Notch信號通路在肝臟發(fā)育中的研究進(jìn)展

程 萍 ，郭傳勇

上海市同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化科，上海200072

1917年，Morgan在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)某種基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺口(notch)，80年代命名此基因為Notch基因。隨后大量的研究表明Notch信號途經(jīng)在神經(jīng)細(xì)胞的分化、脊椎動物體節(jié)的發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用，尤其在肝臟發(fā)育成熟過程中作用巨大［1］。Notch信號通路主要通過介導(dǎo)細(xì)胞的分化抑制信號，從而達(dá)到調(diào)控肝臟生長發(fā)育的目的。

1 Notch信號通路簡介

Notch信號通路有4個核心組件，分別為:DSL配體(Jagged1，Jagged2，Delta-like 1，Delta-like 3，Deltalike 4)、轉(zhuǎn)錄因子(CBF-l，Suppressor of hairless，Lag 1)、Notch 受體(Notch1-4)和靶基因(HES、Hey)［2］。其信號通路途經(jīng)可概括為:Delta→Notch→酶切→NICD→進(jìn)入細(xì)胞核→CSL-NICD復(fù)合體→基因轉(zhuǎn)錄。Notch及其配體均為單次跨膜蛋白，當(dāng)配體(如Delta)和相鄰細(xì)胞的Notch受體結(jié)合后，Notch信號被激活，在G分泌酶(GSI)的酶切作用下，釋放出具有核定位信號的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域NICD(Notch intracellular domain，NICD)，NICD進(jìn)而被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核內(nèi)，并與CSL家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Notch靶基因的表達(dá)［3］。CSL能識別并結(jié)合位于Notch誘導(dǎo)基因的啟動子上的特定的DNA 序列(GTGGGAA)［4］。當(dāng) NICD 不存在時，CSL為轉(zhuǎn)錄抑制因子。當(dāng)結(jié)合NICD時，CSL能誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而引發(fā)后續(xù)分子事件［5］。Notch信號會上調(diào)細(xì)胞膜表面的Notch分子，同時下調(diào)其配體Delta的表達(dá)［6］;Delta表達(dá)的下調(diào)又會上調(diào)細(xì)胞自身Notch分子的表達(dá)。這種正反饋機(jī)制使細(xì)胞Notch及其配體表達(dá)的細(xì)微差別在發(fā)育過程中被逐漸放大，從而決定了細(xì)胞的不同分化方向［7］。同時，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能不借助第二信使和蛋白激酶的參與，直接接受鄰近細(xì)胞的信號并傳到細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［8］。這兩種特性為細(xì)胞分化起始過程的精確調(diào)控奠定了不可或缺的基礎(chǔ)。

2 Notch信號通路在肝臟發(fā)育各個階段的作用

肝臟作為最重要的器官之一，在其發(fā)育中經(jīng)歷了復(fù)雜的過程:包括內(nèi)胚層階段肝臟的特化、肝祖細(xì)胞(hepatoblasts)的形成、肝芽(liver bud)的出現(xiàn)和增殖細(xì)胞命運的選擇(肝向和膽管方向的分化)以及最后細(xì)胞的成熟等。包括Notch信號通路在內(nèi)的各種相關(guān)細(xì)胞信號通路和轉(zhuǎn)錄因子共同發(fā)揮作用調(diào)控這一過程。

2.1 Notch在胚胎肝臟的形成時的作用 哺乳動物的肝臟特化起源于腹側(cè)壁前腸末端內(nèi)胚層，隨著肝細(xì)胞相關(guān)基因的激活，在胚胎發(fā)育到14～20體節(jié)期腹側(cè)壁上皮細(xì)胞增生向外突起形成肝芽［即形成了肝臟區(qū)域(小鼠約在胚胎8.5 d)］，構(gòu)成肝芽的這些細(xì)胞稱之為肝祖細(xì)胞，是構(gòu)成肝臟的主要原始細(xì)胞。肝臟祖細(xì)胞具有雙向分化潛能，能夠向肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化。作為細(xì)胞發(fā)育過程中的方向盤，Notch信號通路對細(xì)胞命運選擇有著極其重要的引導(dǎo)作用。在肝向和膽管方向的分化過程中，Notch信號通路被激活，抑制肝臟祖細(xì)胞的肝向分化，肝臟祖細(xì)胞和肝細(xì)胞的表面標(biāo)志物如白蛋白的表達(dá)下調(diào)，而膽管細(xì)胞標(biāo)志物如 ck7、ck19、整合素 β4 和 HNF-1β 表達(dá)上調(diào)［9］。由此我們推測Notch信號通路控制肝臟祖細(xì)胞向膽向分化。而后續(xù)的研究也證實Notch信號通路在肝臟祖細(xì)胞中的激活抑制其向肝臟分化并誘導(dǎo)其向膽管細(xì)胞特點分化。Geisler等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，Notch-Delta信號通路通過改變胎肝時期肝臟祖細(xì)胞中特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平促進(jìn)其向膽管細(xì)胞分化，而Notch信號下調(diào)則可以誘導(dǎo)肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。此外NICD在肝臟祖細(xì)胞中的異常高表達(dá)，下調(diào)白蛋白的表達(dá)，不僅可以誘導(dǎo)其向膽管細(xì)胞分化而且有效的抑制肝母細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。Croquelois等［11］用Notch基因敲除小鼠模型也證明了這一點，Notch1的缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞持續(xù)增殖，進(jìn)而發(fā)展為結(jié)節(jié)性再生性增生，這表明Notch信號通路可以抑制肝細(xì)胞的增殖。另外體外實驗也表明，Jagged-Notch途徑控制著膽向發(fā)育。如Notch功能缺失突變則造成小鼠膽管結(jié)構(gòu)異常，功能紊亂。肝臟祖細(xì)胞在肝實質(zhì)分化為成熟的肝細(xì)胞，在門靜脈區(qū)周圍則分化為膽管細(xì)胞。我們推斷門靜脈周圍的某種物質(zhì)對肝臟祖細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞起著促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1蛋白聚集在胚胎肝臟的門靜脈周圍，Notch2蛋白在包括肝臟祖細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)肝細(xì)胞中表達(dá)。肝臟祖細(xì)胞與Jagged1的細(xì)胞在門靜脈周圍區(qū)互相作用，從而促進(jìn)膽管方向的分化［12］。膽管板亦是從這兩種細(xì)胞的邊界形成的。這些結(jié)果均表明Notch信號在門靜脈區(qū)肝臟祖細(xì)胞中的激活導(dǎo)致肝臟祖細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化。Notch信號通路在肝臟祖細(xì)胞分化過程中起的重要作用可見一斑。但是有趣的是，HES-1和Notch2的失活只會導(dǎo)致膽管異型［13］，并不能擾亂膽管分化。解釋這一現(xiàn)象有兩個假說:(1)這是Notch信號通路在胚胎期肝臟表達(dá)時有一個或多個突變基因的備份［14］。(2)Notch2基因在膽管分化形成后便會失去作用［15］。

除了Notch信號下調(diào)則可以誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化外，抑瘤蛋白M(oncostatin M，OSM)信號通路也可以促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞向肝臟細(xì)胞分化并進(jìn)一步成熟為具有代謝功能的成熟肝臟細(xì)胞［16］。

2.2 Notch信號通路在肝臟發(fā)育成熟階段的作用肝細(xì)胞的成熟受時間和空間各因素調(diào)節(jié)，肝臟在胚胎期和出生后都是個不斷成熟的持續(xù)過程［17］。Kyrmizi等［18］研究表明，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞成熟的有核心六因子(core of 6 factor)，包括肝細(xì)胞核因子(HNF)-1α、HNF-1β、蛋白質(zhì) FoxA2、HNF-4α1、HNF-6 和核受體同源蛋白 LRH-1 等。Vanderpool等［19］通過 HNF-6、RBP-J基因缺失小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的發(fā)育受核心因子和Notch信號通路等共同調(diào)控。Croquelois等［11］研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠條件性剔除受體Notch1后，肝細(xì)胞的增殖能力可升高8倍，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟重量/體質(zhì)量的指數(shù)增加40%，由此看來Notch信號會抑制成年小鼠肝細(xì)胞的增殖。而 Kohler等［20］研究提示，Notch/Jagged途徑在肝臟再生過程中可被激活，Notch配體Jagged1可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，從而提示Notch信號對肝細(xì)胞增殖存在正性調(diào)控。可見Notch對肝細(xì)胞的調(diào)控是一個十分復(fù)雜的過程，受到內(nèi)因和外因的共同作用。

膽管細(xì)胞的發(fā)育也是一個持續(xù)分化成熟的過程，而且我們了解到膽管細(xì)胞根據(jù)各自所在的分支導(dǎo)管位置，在形態(tài)上以及功能異質(zhì)性上持續(xù)發(fā)生變化［21］，但是其中具體的調(diào)控過程尚未明朗。研究發(fā)現(xiàn)Notch1或者Notch2的異常表達(dá)會導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞的異常分化和異位［22］。由此我們推測膽管細(xì)胞的發(fā)育與Notch信號通路相關(guān)。Kodama等［14］研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路的靶基因HES-1的缺陷會導(dǎo)致小鼠膽管結(jié)構(gòu)缺乏，而這個過程則與Jagged1及其受體Notch2信號通路息息相關(guān)。Jagged1在旁門靜脈間質(zhì)、門靜脈成纖維細(xì)胞以及星狀細(xì)胞中表達(dá)，且已有研究證實，膽管細(xì)胞與Notch2作用后，可以刺激表達(dá)HES-1，促進(jìn)膽管細(xì)胞的增殖，直接調(diào)節(jié)了膽管形成。

3 Notch信號通路與肝臟再生及發(fā)育異常

Notch信號通路在肝臟胚胎發(fā)育和成熟過程中都起了重要作用。不僅如此，Notch與肝臟再生和發(fā)育異常也有很大關(guān)系。肝臟損傷或肝部分切除后，剩余肝臟會代償性再生，肝臟再生的實質(zhì)就是肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)所分泌的肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowth factor，HGF)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)的作用致使肝細(xì)胞的不斷增殖、擴(kuò)增［23］。Zong等［15］通過成功構(gòu)建 Notch/RBP-J信號缺失的小鼠模型及進(jìn)行體外研究均發(fā)現(xiàn)阻斷Notch信號則會導(dǎo)致肝再生功能的障礙，肝細(xì)胞、LSEC增殖能力減弱，肝臟失代償性增大，LSEC去分化，肝血竇阻塞，肝細(xì)胞合成、分泌白蛋白能力減弱。Notch信號缺失會導(dǎo)致肝臟發(fā)育異常具體表現(xiàn)在肝臟穩(wěn)態(tài)的喪失，肝細(xì)胞、LSEC的異常增殖，正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞。由此可見Notch信號通路在肝臟再生和發(fā)育進(jìn)程中扮演著重要角色，可以直接調(diào)控肝細(xì)胞、LSEC的生物學(xué)活性而改變肝再生的進(jìn)程。Tanimizu等［9］研究表明，Notch信號通路可以作用于下游效應(yīng)物Jagged1蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝祖細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平來控制這一過程。Jagged1基因突變會使Notch信號通路異常，導(dǎo)致肝內(nèi)膽管發(fā)育缺陷，引發(fā)Alagille綜合征。Alagille綜合征是一種常染色體顯性遺傳的多臟器發(fā)育異常，累及的臟器包括心、肝、骨骼、眼等［24］。染色體分析發(fā)現(xiàn)，人類 Jagged1基因(JAG1)與該病密切相關(guān)，Alagile綜合征患者的一個JAG1等位基因發(fā)生了多種移碼突變，不能產(chǎn)生正常的翻譯產(chǎn)物，使體內(nèi)JAG1的水平低于正常，提示該綜合征是JAG1分子單倍體性缺乏(haploinsufieiency)所致［25］。另有研究發(fā)現(xiàn)Notch2是除了JAG1外導(dǎo)致該病的第二大基因［26］。而 Nijjar等［27］在多個病肝小膽管處發(fā)現(xiàn)Jagged1表達(dá)增強(qiáng)更提示Notch信號在肝臟膽管缺陷中有著重要作用。介于Notch途徑在胚胎發(fā)育中所起得重要作用，其他多種先天性發(fā)育異常疾病可能也與此途徑有關(guān)。

綜上所述，Notch信號通路在肝臟發(fā)育成熟過程中的重要性已經(jīng)明確。雖然對于Notch信號通路在肝臟組織細(xì)胞間如何相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育成熟的具體機(jī)制尚未明了。但是這些理論大大促進(jìn)了分子生物學(xué)的進(jìn)展，也啟迪了很多臨床實際運用，如使干細(xì)胞體外肝向誘導(dǎo)成為可能，促進(jìn)了肝臟膽管疾病的分析研究和基因治療，為肝臟疾病的治療提供新的思路。甚至我們可以期望應(yīng)用到肝臟疾病的再生治療，作為器官移植的來源途徑之一。同時我們也相信，隨著時間的推移和對Notch信號調(diào)控研究的深入，我們有能力利用Notch信號通路打開調(diào)控細(xì)胞命運之門。

［1］You N，Liu W，Zhong X，et al.Possibility of the enhanced progression of fetal liver stem/progenitor cells therapy for treating end-stage liver diseases by regulating the notch signaling pathway［J］.Arch Med Res，2012，43(7):585-587.

［2］Falix FA，Aronson DC，Lamers WH，et al.Possible roles of DLK1 in the Notch pathway during development and disease［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822(6):988-995.

［3］Zhao WX，Lin JH.Notch signaling pathway and human placenta［J］.Int J Med Sci，2012，9(6):447-452.

［4］Johnson JE，Macdonald RJ.Notch-independent functions of CSL［J］.Curr Top Dev Biol，2011，97:55-74.

［5］Yuan Z，F(xiàn)riedmann DR，Vanderwielen BD，et al.Characterization of CSL(CBF-1，Su(H)，Lag-1)mutants reveals differences in signaling mediated by Notch1 and Notch2［J］.J Biol Chem，2012，287(42):34904-34916.

［6］Majumder R，Roy S，Thakur AR.Analysis of Delta-Notch interaction by molecular modeling and molecular dynamic simulation studies［J］.J Biomol Struct Dyn，2012，30(1):13-29.

［7］Zhang P，Yang Y，Nolo R，et al.Regulation of Notch signaling by reciprocal inhibition of HES1 and Deltex 1 and its role in osteosarcoma invasiveness［J］.Oncogene，2010，29(20):2916-2926.

［8］Murray PJ，Maini PK，Baker RE.Modelling Delta-Notch perturbations during zebrafish somitogenesis［J］.Dev Biol，2013，373(2):407-421.

［9］Tanimizu N，Miyajima A.Notch signaling controls hepatoblast differentiation by altering the expression of liver-enriched transcription factors［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt 15):3165-3174.

［10］Geisler F，Nagl F，Mazur PK，et al.Liver-specific inactivation of Notch2，but not Notch1，compromises intrahepatic bile duct development in mice［J］.Hepatology，2008，48(2):607-616.

［11］Croquelois A，Blindenbacher A，Terracciano L，et al.Inducible inactivation of Notch1 causes nodular regenerative hyperplasia in mice［J］.Hepatology，2005，41(3):487-496.

［12］Flynn DM，Nijjar S，Hubscher SG，et al.The role of Notch receptor expression in bile duct development and disease ［J］.J Pathol，2004，204(1):55-64.

［13］Lozier J，McCright B，Gridley T.Notch signaling regulates bile duct morphogenesis in mice［J］.PLoS ONE，2008，3(3):e1851.

［14］Kodama Y，Hijikata M，Kageyama R，et al.The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts［J］.Gastroenterology，2004，127(6):1775-1786.

［15］Zong Y，Panikkar A，Xu J，et al.Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation ［J］.Development，2009，136(10):1727-1739.

［16］Qian L，Krause DS，Saltzman WM.Enhanced growth and hepatic differentiation of fetal liver epithelial cells through combinational and temporal adjustment of soluble factors［J］.Biotechnol J，2012，7(3):440-448.

［17］Petkov PM，Zavadil J，Goetz D，et al.Gene expression pattern in hepatic stem/progenitor cells during rat fetal development using complementary DNA microarrays ［J］.Hepatology，2004，39(3):617-627.

［18］Kyrmizi I，Hatzis P，Katrakili N，et al.Plasticity and expanding complexity of the hepatic transcription factor network during liver development［J］.Genes Dev，2006，20(16):2293-2305.

［19］Vanderpool C，Sparks EE，Huppert KA，et al.Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and Notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo ［J］.Hepatology，2012，55(1):233-243.

［20］Kohler C，Bell AW，Bowen WC，et al.Expression of Notch-1 and its ligand Jagged-1 in rat liver during liver regeneration ［J］.Hepatology，2004，39(4):1056-1065.

［21］Strazzabosco M，F(xiàn)abris L.Functional anatomy of normal bile ducts［J］.Anat Rec(Hoboken)，2008，291(6):653-660.

［22］Zaret KS，Grompe M.Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas［J］.Science，2008，322(5907):1490-1494.

［23］Avruch J，Lin Y，Long X，et al.Recent advances in the regulation of the TOR pathway by insulin and nutrients［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2005，8(1):67-72.

［24］Tada M，Itoh S，Ishii-Watabe A，et al.Functional analysis of the Notch ligand Jagged1 missense mutant proteins underlying Alagille syndrome［J］.FEBS J，2012，279(12):2096-2107.

［25］Wang H，Wang X，Li Q，et al.Analysis of JAG1 gene variant in Chinese patients with Alagille syndrome［J］.Gene，2012，499(1):191-193.

［26］Kamath BM，Bauer RC，Loomes KM，et al.NOTCH2 mutations in Alagille syndrome［J］.J Med Genet，2012，49(2):138-144.

［27］Nijjar SS，Wallace L，Crosby HA，et al.Altered Notch ligand expression in human liver disease:further evidence for a role of the Notch signaling pathway in hepatic neovascularization and biliary ductular defects［J］.Am J Pathol，2002，160(5):1695-1703.