草魚與團頭魴腸道菌群結構比較分析

王 純倪加加顏慶云李金金李星浩余育和

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學,北京 100049; 3. 廣東省微生物研究所, 廣州 510070; 4. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070; 5. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070)

草魚與團頭魴腸道菌群結構比較分析

王 純1,2倪加加3,4,5顏慶云1李金金1,2李星浩1,2余育和1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學,北京 100049; 3. 廣東省微生物研究所, 廣州 510070; 4. 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室, 廣州 510070; 5. 廣東省微生物應用新技術公共實驗室, 廣州 510070)

選取湖泊養(yǎng)殖的草魚(Ctenopharyngodon idellus)和團頭魴(Megalobrama amblycephala)為研究對象, 通過對其消化道細菌群落16S rDNA進行細菌群落聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析, 比較了其消化道微生物群落結構。在兩種草食性魚類消化道中分別檢測到不同的譜帶, 其中草魚的平均譜帶數(shù)為(33.3±2.8)條, 團頭魴的平均譜帶數(shù)為(38.0±2.5)條?；谒?PCR-DGGE指紋圖譜譜帶豐度值數(shù)據(jù)的UPGMA聚類分析和 PCA排序均顯示草魚消化道微生物群落并沒有與團頭魴消化道微生物群落分開; 相比于草魚和團頭魴消化道微生物群落之間的差異, 草魚和團頭魴個體間差異更加明顯, 而且草魚消化道微生物群落的個體分化更為明顯。對特定條帶的切膠回收測序結果顯示, 草魚和團頭魴消化道內檢測到的菌群都主要來自γ-變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門, 另外草魚消化道中還檢出少量擬桿菌門細菌。以上結果表明同一生境中食性相同的野生草魚與團頭魴消化道微生物群落組成不存在顯著差異, 條帶回收測序檢測到相似的微生物種類。研究結果補充了人們在食性對消化道微生物群落結構影響方面的認識, 同時也暗示草魚和團頭魴消化道內微生物群落對營養(yǎng)物質的代謝方式類似, 這為深入研究草食性魚類消化道微生物菌群參與營養(yǎng)物質代謝積累了資料。

草魚; 團頭魴; 消化道細菌群落; PCR-DGGE

宿主消化道中生存著大量的微生物, 經(jīng)過長期的共進化, 這些微生物與宿主之間形成了相對穩(wěn)定的互利共生關系[1—4]。一方面, 宿主消化道為各種微生物提供相對穩(wěn)定的生存環(huán)境和持續(xù)的營養(yǎng)物質供應; 另一方面, 消化道微生物也直接或間接參與宿主的發(fā)育、營養(yǎng)、免疫等諸多生理生化過程[5—11]。近年來, 食物組成對消化道微生物群落結構和功能的影響成為研究熱點。如Li等[12]通過對受試人員食譜中添加十字花科蔬菜發(fā)現(xiàn)其顯著影響了人類糞便樣品中的微生物群落結構。Kocherginskaya等[13]通過使用兩種不同成分的飼料喂養(yǎng)公牛探究其瘤胃中細菌類群變化, 研究結果表明兩種飲食條件下公牛瘤胃內微生物群落差異顯著, 飼喂玉米的公牛瘤胃中的微生物在數(shù)量和種類上都明顯高于飼喂干草的公牛瘤胃中的微生物。不僅在陸生脊椎動物, 在水生脊椎動物魚類中同樣有相似的研究報道, 如Ring?等[14]以 5種不同食物組成的飼料對大西洋鮭魚進行為期 28d的投喂實驗, 對其中腸和后腸的微生物菌群進行分析, 結果顯示不同飲食條件下大西洋鮭的腸道菌群結構存在差異。McKellep等[15]對大西洋鮭分別投喂含有大豆餅、菊粉和氧四環(huán)素的飼料, 結果顯示后腸中附著菌群存在差異, 其中投喂大豆餅組魚體后腸內附著菌群不僅數(shù)量上更多, 而且具有更高的菌群結構多樣性。以上研究結果表明無論在陸生脊椎動物還是水生脊椎動物, 宿主食物組成都是影響其消化道微生物群落的重要因素。在水生脊椎動物中, 草食性魚類以其能以陸生或水生植物為主要食物來源而成為重要研究對象, 本文以淡水草食性魚類為研究對象, 探索這一特殊食性魚類的消化道微生物菌群結構。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)和團頭魴(Megalobrama amblycephala)為典型的草食性魚類[16],且草魚是目前世界上產(chǎn)量最大的淡水經(jīng)濟魚類(FAO, http://www.fao.org), 團頭魴是我國特有的優(yōu)良淡水魚類[17], 它們不僅在我國淡水養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位, 在維持淡水生態(tài)系統(tǒng)的平衡方面也有重要作用。本研究以湖泊天然水體養(yǎng)殖的草魚(Ctenopharyngodon idellus)和團頭魴(Megalobrama amblycephala)為研究對象, 采用 PCR-DGGE指紋分析結合 DNA測序技術比較分析其消化道微生物群落結構特征, 希望能為深入闡述草食性魚類消化道內特定微生物菌群參與營養(yǎng)物質代謝提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況

武漢市武湖(N 30°47′, E 114°28′), 位于湖北省武漢市黃陂區(qū)境內, 為長江中游中型淺水富營養(yǎng)化湖泊[18], 湖區(qū)面積約20 km2, 最大水深4.2 m, 平均水深2.6 m。水生植被覆蓋率為30%—40%[19], 據(jù)夏文凱等研究, 武湖水生維管束植物主要有4科5種,沉水植物主要有聚草(Myriophyllum spicatum)、苦草(Vallisneria spiralis)、金魚藻(Ceratophyllum demersum)、菹草(Potamogeton crispus)[20]。

1.2 樣品采集

本實驗所用草魚、團頭魴于2012年11月21日采自武漢市武湖(表 1), 選取大小相近個體各三條,活魚充氧運回實驗室后立即在無菌條件下進行解剖,分別剪取前、中、后腸, 用無菌水沖洗腸內容物并收集于2 mL無菌離心管中。

表1 樣本基本信息Tab. 1 Basic information of samples

1.3 腸道微生物總DNA提取

草魚和團頭魴消化道微生物中 DNA提取參考Ni等[21], 即向每管腸道內容物中加入 1200 μL裂解液(10 mmol/L Tris-Cl; 0.5% SDS; 100 mmol/L EDTA; 0.1 mg/mL蛋白酶K; 50 μg/mL RNase A), 于55℃中水浴裂解12h; 室溫離心后取上清轉入新無菌離心管中采用常規(guī)酚-氯仿法進行抽提, 隨后用 4℃保存的70%酒精洗滌3次后自然風干, 風干后的DNA重懸于100 μL 無菌雙蒸水中, 保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增

采用細菌16S rRNA基因通用引物F357-GC (5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和R518 (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)對腸道內容物樣品中細菌類群進行PCR-DGGE分析[22]。PCR反應體系為每25 μL反應混合液包含: 2.5 U Taq DNA聚合酶(Fermentas, 美國), 80 μmol/LdNTP (Fermentas,美國), 2 mmol/L MgCl2(Fermentas, 美國), 正反向引物各0.2 μmol/L, 1 × buffer (Fermentas, 美國),細菌DNA模版2 μL。PCR反應在S1000TM熱循環(huán)儀(Bio-Rad, 美國)上進行, 反應條件為: 94℃預變性10min; 隨后進行 10個循環(huán)的降落 PCR (94℃變性45s, 68—59℃退火30s, 每個循環(huán)降低1 , 72℃ ℃延伸 1min); 然后再進行 25個循環(huán)的常規(guī) PCR擴增(94℃變性45s, 58℃退火30s, 72℃延伸1min); 最后72℃延伸10min。取5 μL PCR產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖膠100 V穩(wěn)壓電泳30min以檢測PCR擴增效果。

1.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

PCR擴增所得產(chǎn)物在 9%(w/v)膠濃度的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳, 變性范圍為 40%—70%, 電泳條件為60℃條件下120 V預電泳10min, 然后100V穩(wěn)壓電泳12h。凝膠用1 × SYBR Gold染色30min后在BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad,美國)下成像。

1.6 測序

從變性梯度凝膠上回收需要測序的條帶, 加100 μL無菌水溶解, 取2 μL DNA模版用不帶GC夾板的引物F357和R518進行PCR擴增, PCR擴增條件同上, PCR產(chǎn)物用 DNA凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國)進行回收純化, 純化后的DNA片段用pMD18-T載體(TaKaRa, 日本)轉化入Escherichia coli DH5α菌株培養(yǎng)后進行PCR檢測, 合格的菌斑送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad, 美國)軟件導出變性梯度凝膠電泳圖譜條帶豐度數(shù)據(jù)矩陣。借助XLSTAT-Pro 7.5軟件依據(jù)條帶豐度值做UPGMA聚類分析, 并運用canoco4.5軟件對數(shù)據(jù)進行PCA分析。測序所得序列運用 NCBI中 VecScreen工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen)除去載體, 再次去除引物后將所得序列結果在RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu)中進行比對。運用 ClustalX (version 1.83)和MEGA安裝包(4.0)[23]構建系統(tǒng)發(fā)生樹, 采用鄰接法(NJ)進行分析, 并進行 1000次重復的bootstrap驗證。

2 結果

2.1 DGGE指紋圖譜

針對細菌16S rRNA基因進行的DGGE圖譜分析共檢測到91種DGGE帶型(圖1)。其中有30條譜帶僅在單個泳道檢出, 沒有檢測到在所有泳道都出現(xiàn)的共有條帶。草魚消化道內檢測到的平均譜帶數(shù)為(33.3±2.8)條, 團頭魴消化道檢測到的平均譜帶數(shù)為(38.0±2.5)條。

2.2 消化道微生物群落結構比較

UPGMA聚類分析顯示草魚消化道微生物群落并沒有完全與團頭魴消化道微生物群落分開; 相比于草魚和團頭魴消化道微生物群落之間的差異, 草魚和團頭魴個體間差異更加明顯, 而且草魚消化道微生物群落的個體分化更為明顯, 如1號草魚樣品、2號草魚樣品、3號草魚樣品分別聚為不同的聚類枝,而團頭魴則只有6號樣品聚為一支, 并嵌入到4號前腸和5號后腸聚的進化枝中; 4號團頭魴其他樣品與5號團頭魴其他樣品則沒有很好地分開(圖2a)。PCA排序結果同樣顯示除了1號草魚樣品和6號團頭魴樣品與其他樣品不同之外, 其他的樣品都沒有很好地區(qū)分開, 這一結果同樣說明草魚和團頭魴消化道微生物群落結構并沒有明顯地分開(圖2b)。

圖 1 草魚和團頭魴消化道微生物群落變性梯度凝膠(DGGE)電泳圖Fig. 1 DGGE profile of the gut microbial communities from grass carp and bluntnose black bream

2.3 DGGE譜帶測序分析

本實驗一共測得24條DGGE條帶對應的DNA序列(表2)。將所得序列進行RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp. cme.msu.edu)比對, 置信度閾值為80%[24]。結果顯示草魚消化道內菌群主要是γ-變形菌門 (γ-Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)還有少量厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes); 團頭魴消化道內菌群與草魚相似, 主要為 γ-變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門, 但未檢測到擬桿菌門細菌。其中, 氣單胞菌屬和 Cetobacterium屬細菌是草魚和團頭魴消化道中的優(yōu)勢菌群; 另外, 團頭魴消化道內還檢測到魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬細菌,但未檢測到擬桿菌門細菌。同時結合RDP和NCBI數(shù)據(jù)庫比對結果運用MEGA安裝包(4.0)構建NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3)。

圖2 16S rDNA指紋圖譜的相似性分析Fig. 2 The similarity of the gut microbiota from the grass carp and bluntnose black bream

表2 DGGE條帶測序序列和相似性物種Tab. 2 Sequences and corresponding species of DGGE bands

3 討論

圖3 由DGGE回收條帶測序所得的16S rDNA序列相似性比較所建NJ進化樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree showing the sequences similarity of 16S rDNA retrieved from excised DGGE bands

宿主消化道內生活著大量的微生物, 就人類而言, 消化道內微生物細胞在數(shù)量上至少是人類體細胞數(shù)量的十倍[25]。這些微生物生態(tài)系統(tǒng)在宿主體內發(fā)揮著重要的生理功能。目前為止, 國內外學者已對動物消化道微生物開展了廣泛深入的研究, 如Rawls等[26]以無菌斑馬魚為模型研究其消化道微生物時發(fā)現(xiàn), 斑馬魚消化道內微生物能夠調節(jié)腸道212 個基因的表達, 且其中一部分能夠刺激上皮細胞增殖、促進營養(yǎng)物質代謝和先天性免疫應答。盡管目前已經(jīng)證實消化道微生物是維持宿主健康不可或缺的因素, 但消化道內微生物群落結構并不是固定不變的, 宿主的食物組成、生活環(huán)境、健康狀況等因素都會影響宿主的消化道微生物群落結構,而食物組成對宿主消化道微生物群落結構的影響目前已開展了廣泛的研究, 并證實宿主的食性和食物組成會對群落結構造成明顯的影響, 如Ring?等[27]對北極嘉魚(Salvelinus alpinus L.)分別投喂等比例替代的糊精和菊粉飼料, 研究結果表明投喂兩種食物的北極嘉魚后腸中微生物組成存在差異, 投喂糊精組魚體后腸中優(yōu)勢菌群為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微球菌屬(Micrococcus)、水棲嗜冷桿菌(Psychrobacter glacincola)和鏈球菌屬(Streptococcus), 而投喂菊粉組優(yōu)勢菌群為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。Syvokien?和Mick?nien?[28]對波羅的海沿岸的 10種海洋魚類的消化道微生物群落進行周年跟蹤研究, 數(shù)據(jù)顯示不同食性魚類之間的腸道微生物菌群存在顯著差異。Ward等[29]通過16S rDNA克隆文庫方法對南極地區(qū)南極魚科的雜食性魚類Notothenia coriiceps和專一肉食性魚類 Chaenocephalus aceratus消化道微生物群落進行分析, 結果顯示雜食性的N. coriiceps腸道微生物多樣性比肉食性的C. aceratus豐富。這些研究結果證實了宿主食性和食物組成是影響其消化道微生物群落結構的重要因素。顏慶云等[30]對以浮游生物為主要食物來源的鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)腸含物進行PCR-DGGE分析, 指紋圖譜的聚類結果顯示鰱、鳙并沒有完全分開, 而是存在交叉。本實驗研究結果也顯示同為草食性的草魚和團頭魴消化道微生物群落結構并沒有明顯的不同, 這再次證明食性相同的魚類消化道微生物群落結構類似,并暗示它們消化道內微生物群落對營養(yǎng)物質的代謝方式可能類似。

Han等[31]運用克隆文庫方法分析了投喂商業(yè)飼料的混養(yǎng)池塘內草魚腸道內容物、池塘水體、沉積物、商業(yè)飼料和蘆葦?shù)募毦M成, 研究發(fā)現(xiàn)草魚腸道內主要菌群為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。Wu等[32]以池塘飼喂黑麥草草魚為實驗對象, 通過高通量測序研究發(fā)現(xiàn)草魚消化道內存在核心微生物群落, 為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。本實驗的測序結果顯示草魚消化道內菌群主要是 γ-變形菌門、梭桿菌門還有少量厚壁菌門和擬桿菌門; 團頭魴消化道內菌群與草魚相似, 主要為 γ-變形桿菌、梭桿菌門和厚壁菌門, 但未檢測到擬桿菌門細菌,這些與前面研究人員的結果基本一致。而且檢測到氣單胞菌屬和 Cetobacterium屬為草魚和團頭魴消化道內共有的優(yōu)勢菌群, 這一研究結果與 Ni等[21]對池塘飼料養(yǎng)殖草魚和洞庭湖野生草魚的研究結果一致。以上研究表明來自不同生境的草魚消化道主要微生物群落組成基本相同, 不具有生境特異性,推測其消化道內存在核心微生物組成。在研究雜食性魚類中, 薛恒平等[33]報道雜食性魚類消化道內優(yōu)勢菌群為弧菌和氣單胞菌; 周金敏[34]通過對肉食性魚類黃顙魚腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)其腸道內的優(yōu)勢菌群為氣單胞菌屬、腸桿菌科和不動桿菌屬; 李學梅等[35]對三種室內飼養(yǎng)魚類腸道微生物群落進行PCR-DGGE分析顯示, 偏肉食性的斑點叉尾 腸道中菌群主要屬于變形桿菌門, 而偏雜食性的銀鯽和異育銀鯽腸道中主要為梭桿菌門和氣單胞屬菌。以上針對雜食性和肉食性魚類的研究結果與本研究中草食性魚類消化道內微生物組成還是有所區(qū)別。綜合以上分析, 本文推測草食性魚類消化道內優(yōu)勢微生物類群基本維持不變, 宿主食性可能是維持魚類消化道微生物群落結構的重要因素。

另外, 從本實驗的研究結果還發(fā)現(xiàn), 草魚消化道微生物群落個體分化明顯, 其中草魚 2號樣本的譜帶數(shù)明顯高于其他兩個樣本; 相似的, 2號團頭魴樣本的譜帶數(shù)明顯低于其他兩樣本。且切膠測序結果同樣發(fā)現(xiàn)草魚和團頭魴個體間存在差異, 已有研究表明動物體消化道微生物能夠受宿主發(fā)育階段、飲食、健康狀況和生活環(huán)境等因素影響。如Fujimura等[36]研究表明宿主的健康狀況和腸道微生物相互影響, 且宿主機體的生態(tài)失衡能夠改變腸道微生物群落組成。Moran等[37]對來自新西蘭東北部海岸的海洋草食性魚類雪梨舵魚開展的研究發(fā)現(xiàn), 雪梨舵魚腸道細菌群落組成受魚體不同發(fā)育階段影響。本實驗所反映的草魚和團頭魴消化道微生物均存在個體差異, 其原因還有待進一步深入探究。隨著高通量測序技術的飛速發(fā)展, 宏基因組測序已經(jīng)廣泛應用于動物體腸道微生物研究, 這將為研究魚類腸道菌群個體差異提供更好的研究手段, 以期更加深入的揭示消化道微生物與魚源宿主的精密關系。

總之, 本實驗通過PCR-DGGE技術比較了草魚和團頭魴消化道微生物群落結構并對特定條帶進行回收測序, 檢測到兩種魚消化道內主要微生物組成相似, 消化道微生物群落結構不存在顯著性差異,但檢測到草魚和團頭魴個體間存在差異。

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COMPARISON OF THE INTESTINAL BACTERIAL COMMUNITIES BETWEEN GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS) AND BLUNTNOSE BLACK BREAM (MEGALOBRAMA AMBLYCEPHALA)

WANG Chun1,2, NI Jia-Jia3,4,5, YAN Qing-Yun1, LI Jin-Jin1,2, LI Xing-Hao1,2and YU Yu-He1
(1. Key Laboratory of Biodiversity and Conservation of Aquatic Organisms, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China; 4. State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China (The Ministry-Province Joint Development), Guangzhou 510070, China; 5. Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070, China)

To compare the intestinal bacterial communities of two commercial herbivorous fishes (grass carp and bluntnose black bream), we conducted polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) of 16S rRNA genes. Fishes captured from Wuhu Lake were used to isolate and amplify the variable V3 region of 16S rRNA gene with bacterial domain-specific primers F357 (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′ with GC clamp in the 5′end) and 518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′). Using both the unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) clustering and principal component analysis (PCA) ordination, we observed that the intestinal bacterial communities of the two herbivorous fishes were similar but the individual differences appeared to be more obvious. The results of sequence showed that γ-Proteobacteria, Fusobacteria, Firmicutes exist both in the intestine of the grass carp and bluntnose black bream; while Bacteroidetes only exist in the bluntnose black bream. A further investigation of feeding habits on bacterial community construction may be of benefit to the aquacultural fundamental research.

Grass carp; Bluntnose black bream; Intestinal bacterial community; Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis

Q938.1+5

A

1000-3207(2014)05-0868-08

10.7541/2014.130

2013-08-09;

2014-03-01

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2009CB118705); 國家自然科學基金(31372190)資助

王純(1988—), 男, 安徽潛山縣人; 碩士研究生; 主要從事微生物分子生態(tài)學研究。E-mail: chun_wang2007@163.com

余育和(1956—), 男, 湖南汨羅人; 研究員; 主要從事原生動物學研究。E-mail: yhyu@ihb.ac.cn