三種霉菌產(chǎn)纖維素酶能力分析與培養(yǎng)條件優(yōu)化

三種霉菌產(chǎn)纖維素酶能力分析與培養(yǎng)條件優(yōu)化

胡翠英 李良智 趙建 錢瑋 顧華杰
（蘇州科技學院 化學生物與材料工程學院，蘇州 215009）

對實驗室現(xiàn)有3種真菌產(chǎn)纖維素酶能力的分析及培養(yǎng)條件優(yōu)化。比較了3種菌在剛果紅培養(yǎng)基上的透明圈大小、并分析產(chǎn)纖維素酶酶活；通過單因素與響應面分析的方法優(yōu)化毛酶產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件。通過試驗得出3種真菌均能產(chǎn)纖維素酶，毛霉能產(chǎn)較多的纖維素酶。毛霉產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為：pH 5.0，轉速 220 r/min，發(fā)酵時間47 h，發(fā)酵溫度 35 ℃，纖維素酶活為6.99 U/mL。毛霉、青霉、曲霉均產(chǎn)纖維素酶，毛霉能降解玉米芯纖維素。

霉菌 纖維素酶 培養(yǎng)條件 優(yōu)化

節(jié)約糧食和提高農(nóng)副產(chǎn)品的利用率，減少農(nóng)業(yè)廢棄物燃燒帶來的環(huán)境污染問題，已經(jīng)引起眾多人的關注，將農(nóng)業(yè)廢棄物轉為可利用能源成為大家研究的課題。我國北方每年都有大量玉米芯被焚燒，如能加以利用，將節(jié)約原料成本，故降解此物成為本研究的目的。但一方面由于半纖維素與木質(zhì)素等組成的致密結構，另一方面纖維素本身不能為丙酮丁醇梭菌直接利用，故需先進行一連串的預處理、酶解等［1-3］，將纖維素降解為葡萄糖、木糖等單糖。纖維素酶的提取過程［4，5］較繁瑣，酶損失較大，成本較高，如能直接利用纖維素酶產(chǎn)生菌降解纖維素為單糖，可省去酶的提取、純化的過程，減少酶活力損失、節(jié)約成本。其降解物直接作為產(chǎn)能源菌的碳源，形成兩菌共培養(yǎng)的情形。目前纖維素降解菌研究［6-9］中多為真菌，且大多為青霉、曲霉、木霉等。本文的主要研究內(nèi)容為從實驗室現(xiàn)有霉菌中尋找纖維素降解菌，比較纖維素酶活，優(yōu)化培養(yǎng)條件，為進行共培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 青霉、毛霉、曲霉，來自本實驗室。玉米芯：來自山西農(nóng)村，往年擱置1年，風干粉碎過40目篩子備用。

1.1.2 主要儀器 纖維素酶活測定采用723PC型分

光光度計（上海欣茂），發(fā)酵溶劑分析用氣相色譜儀GC112A型（上海精科），F(xiàn)ID檢測器，PEG毛細管柱。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基 檸檬酸、檸檬酸鈉、CMC-Na、纖維素酶、3，5-二硝基水楊酸。

菌種培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g、NaNO32 g、K2HPO4·3H2O 1 g、 KCl 0.5 g 、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、纖維素粉1.88 g、剛果紅0.2 g、瓊脂15 g、明膠2 g，蒸餾水1 000 mL，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

玉米芯粉剛果紅瓊脂培養(yǎng)基：將纖維素剛果紅瓊脂培養(yǎng)基中的纖維素粉換成預處理玉米芯粉。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨 3 g、酵母膏0.2 g、（NH4）2SO42 g、KH2PO44 g、CaCl2·7H2O 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、CMC-Na 10 g、蒸餾水1 000 mL中，加熱至溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 玉米芯預處理 稱取15 g玉米芯粉，加入120 mL蒸餾水，滴加3%的硫酸，調(diào)pH 2-3，25℃處理48 h，70℃處理10 h，高溫110℃處理0.5 h，過濾，干燥備用。

1.2.2 纖維素酶產(chǎn)生菌鑒定 在菌種培養(yǎng)基上，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。吸取稀釋好的菌液于剛果紅鑒定平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2-3 d，轉到4℃冰箱，有利于釋放菌體中的纖維素酶，觀察透明圈。挑取單菌落做成斜面。

1.2.3 測定纖維素酶活 挑取透明圈較大的菌落，接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃，培養(yǎng)24 h，離心，取得粗酶液，測定總酶活。測定方法CMCNa酶活，見文獻［9］。每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量，定義為一個酶活單位（U）。

酶活計算公式：酶活力（U/mL）=還原糖量/30*Ew

其中，30為水浴保溫時間，Ew為粗酶液的體積。

1.2.4 優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件 采用單因素試驗，改變pH（分別為2、4、6、8、10）、搖床轉速（分別為100、150、200、250、300 r/min）、培養(yǎng)溫度（分別為20℃、30℃、40℃、50℃）、發(fā)酵時間（分別為24、48、72、96、120 h）等培養(yǎng)條件。根據(jù)單因素的試驗結果，進行響應面分析，優(yōu)化試驗結果。

2 結果

2.1 比較3種菌的纖維素降解能力

通過計算剛果紅培養(yǎng)基上透明水解圈與菌落直徑的比值、產(chǎn)酶培養(yǎng)基中菌種產(chǎn)酶活力分析3種菌的纖維素降解能力。表1為3種菌分別在碳源為纖維素粉或經(jīng)預處理的玉米芯粉培養(yǎng)基上透明圈與菌落直徑比。結果表明，青霉、毛霉、曲霉均可在纖維素粉培養(yǎng)基和玉米芯粉培養(yǎng)基上生長，但在纖維素粉培養(yǎng)基上的菌落直徑較大，3種菌對玉米芯的利用能力較弱。毛霉的D/d值較其它兩種菌大，相對而言毛霉產(chǎn)纖維素酶活較大。圖1比較了不同真菌產(chǎn)酶的CMCase酶活力，進一步說明毛霉總酶活較高，達到3.28 U/mL，因此后續(xù)優(yōu)化試驗以毛霉為研究對象。

表1 不同菌株在剛果紅培養(yǎng)基上透明圈直徑比

2.2 單因素試驗

不同pH條件下酶活力中心可解離基團的結構不同，由圖2可知，酶活力隨pH的升高先升高后下降，且經(jīng)F檢驗得出毛霉產(chǎn)纖維素酶的最適初始pH值為4-6之間，其酶活力約為3.7 U/mL。

轉速是影響好氧菌生長的重要參數(shù)。從圖3可

看出，酶活隨著轉速的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且經(jīng)F檢驗，搖床轉速在200 r/min左右，有較好的產(chǎn)纖維素酶能力，可達到2.1 U/mL。

圖1 不同菌種纖維素酶活

圖2 初始pH對纖維素酶活的影響

圖3 搖床轉速對纖維素酶活的影響

酶活隨培養(yǎng)時間長短不同而不同。圖4體現(xiàn)為酶活力在培養(yǎng)48 h時最高，在培養(yǎng)時間低于48 h的范圍內(nèi)，酶活力隨時間的增大而變大，培養(yǎng)48 h時酶活最大為4.985 U/mL。培養(yǎng)時間超過48 h后，酶活力隨時間的增大而逐漸變小，這應該與底物濃度降低以及代謝產(chǎn)物抑制有關。

同樣，每種微生物都有一個最適宜纖維素酶保持酶活的溫度范圍。圖9中酶活力在培養(yǎng)溫度在40℃時最高，在低于40℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高而變大，但是在大于40℃的范圍內(nèi)，隨溫度的升高而逐漸變小。說明溫度在40 ℃左右比較適合毛霉產(chǎn)生纖維素酶并保持酶活。

圖4 培養(yǎng)時間對纖維素酶活的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對纖維素酶活的影響

2.3 響應面分析

為使發(fā)酵條件優(yōu)化，在對2.3試驗結果分析的基礎上設置響應面試驗，選用pH（x1）、轉速（x2）、培養(yǎng)時間（x3）、培養(yǎng)溫度（x4）四種因素三水平設計?；疽罁?jù)2.3結果中較佳條件向兩邊擴充。試驗設計及試驗結果見表2，變量分析見表3。

如果P＜0.05，則說明模型中項的影響是顯著的，在這個模型中x3即培養(yǎng)時間是模型的顯著項。失擬項反應的是實驗數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，它的值為1.87，與整個模型的99.14比起來較小，表示不符合的數(shù)據(jù)相對于純誤差不顯著，即這個模型是比較符合實際數(shù)據(jù)。

根據(jù)Matlab與Design expert所做的分析，得二次擬合回歸方程：

酶活＝5.81-0.0908×x1-0.0608×x2-0.2433× x3+0.1533×x4-0.1125×x12+0.0100×x22-5.0512× x32+0.2613×x42-0.2350×x1×x2-0.0650×x1×x3-0.3075×x1×x4-0.0125×x2×x3+0.0150×x2×x4-0.0425×x3×x4

對模型進行方差分析得R2=0.991 4，說明方程有較好的擬合度，方程與實際情況比較相符，并能作出相對準確的預測。

圖6中3個響應面圖說明4個因素對酶活影響趨勢與單因素試驗結果相同，4個因素中發(fā)酵時間

是最大的影響因素。對方程求偏導為=0，得出最佳條件為：pH 5.0，轉速 222 r/min，發(fā)酵時間47.4 h，發(fā)酵溫度 35.4℃。

表2 三水平因子試驗設計及試驗結果

表3 三水平因子變量分析表

圖6 pH、轉速、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度對濾紙酶活的響應面圖

為驗證模型的符合度，做了驗證試驗，配制pH為5.0的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，準備4個250 mL的搖瓶，倒入50 mL配制好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，放置于溫度35 ℃，220 r/min，培養(yǎng)47 h，測定酶活。驗證試驗酶活力為6.99U/mL，方差不顯著，符合預期，所以模型可信，且所得值是本篇論文中最高值。

利用考馬斯亮藍法測得蛋白質(zhì)含量為6.81 μg/ mL，得酶比活1.03×106。實驗室購買的纖維素酶比活為3.00×104，說明在酶的提取純化過程中，損失酶活。所以，如能進一步提高酶蛋白的產(chǎn)量，省略酶的提取純化過程，直接用于纖維素降解，降解產(chǎn)物直接被產(chǎn)能源的菌利用，可節(jié)約成本。

3 討論

纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的大分子，Wood等［10-11］研究表明剛果紅與D-葡萄糖的β-1，4糖苷鍵、D-葡萄糖的β-1，3糖苷鍵等有較強的作用，顯示紅色。隨著纖維素的降解，紅色減弱形成透明圈，因此剛果紅染料可用于鑒定纖維素酶的存在［12-14］。通常透明圈大小與菌落直徑的比值同纖維素酶活間有一定關系，比值較大，則酶活相對較高［12，14，15］。試驗室3種真菌青霉、毛霉、曲霉，均可產(chǎn)生纖維素酶，其中毛霉纖維素酶活相對較高。青霉屬、曲霉屬中也有產(chǎn)纖維素酶活較高的菌種，如許玉林等［17］得到的草酸青霉，習興梅等［18］得到的黑曲霉等。本實驗室現(xiàn)有的青霉、曲霉相對較弱。

影響產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件中，毛霉產(chǎn)纖維素酶的最適培養(yǎng)基初始pH5.0，與相關文獻中真菌產(chǎn)纖維素酶的最適pH范圍相似［6，12］?？梢娒篂榉鞘人峄蚴葔A類細菌，中性偏酸的培養(yǎng)條件較適合其纖維素酶的生產(chǎn)。搖床轉速220 r/min，毛霉為好氧菌，搖床轉速對毛霉的生長較重要，轉速太低，溶氧不足；轉速太高，對毛霉剪切力較大［16］。每種微生物都有一個最適宜生長的溫度范圍［16］，本試驗中溫度為35℃。

從試驗結果分析，毛霉產(chǎn)酶活并不是很高，且完全降解纖維素僅靠1種微生物是難實現(xiàn)的，所以菌株的協(xié)同效應在纖維素降解中尤為重要。在選擇菌種時應充分考慮菌株之間的協(xié)同作用，防止拮抗作用的發(fā)生。試驗初步探討了毛霉的產(chǎn)酶效果，對纖維素的高效降解具有一定的理論指導意義，至于菌株的產(chǎn)酶機理還有待于進一步研究。

4 結論

通過對纖維素總酶活的測定與比較，得出毛霉產(chǎn)酶活最高。通過對毛霉產(chǎn)酶條件的單因素試驗與

響應面分析優(yōu)化，得出較佳條件：pH 5.0，轉速 222 r/min，發(fā)酵時間47.4 h，發(fā)酵溫度 35.4度條件下產(chǎn)酶活最高為6.99 U/mL。

［1］ Qureshi N, Ezeji TC, Ebener J, et al. Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I：Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber［J］. Bioresource Technology, 2008, 99（13）：5915-5922.

［2］ Qureshi N, Saha BC, Dien B, et al. Production of butanol（a biofuel）from agricultural residues：Part I Use of barley straw hydrolysate［J］. Biomass and Bioenergy, 2010, 34（4）：559-565.

［3］ 陳守文, 馬昕, 汪履綏, 趙學慧. 稻草酶法水解液的丙酮丁醇發(fā)酵［J］. 工業(yè)微生物, 1998, 28（4）：30-34.

［4］ 繆靜, 張術臻, 程顯好, 等. 纖維素酶提取工藝及酶學性質(zhì)的研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2008, 36（19）：7954 - 7955, 7960.

［5］ 東平, 龐延軍, 李兆蘭. 綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的提取分離及其性質(zhì)［J］. 徐州師范學院學報, 1996, 14（2）：62-66.

［6］ 韓陽. 黑曲霉對海帶纖維素降解條件的研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2010（3）：358-360.

［7］ 孫軍德, 陳南. 秸稈纖維素降解細菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究［J］. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報, 2010, 41（2）：210-213.

［8］ 王洪媛, 范丙全. 三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果［J］. 微生物學報, 2010, 50（7）：870-875.

［9］ 張濤, 皮雄娥, 劉偉, 朱立穎, 王欣. 纖維素降解菌的篩選和鑒定［J］. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26（4）：418-420.

［10］ Wood PJ. Factors affecting precipitation and spectral changes associated with complex-formation between dyes and β-D-glucans［J］. Carbohydrate Research, 1982, 102（1）：283-293.

［11］ Teather RM, Wood PJ. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43（4）：777-780.

［12］ 買爾哈巴·艾合買提, 樊振, 李越中, 等. 瘤胃中纖維素分解菌的分離、鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化［J］. 微生物學報, 2013, 53（5）：470-477.

［13］ 張歡, 寇巍, 王曉明, 等. 產(chǎn)纖維素酶菌株的選育分析及發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］. 環(huán)境化學, 2013, 32（4）：605-611.

［14］ 馬雪姣, 李靜, 徐靜靜, 楊力. 奶牛糞便纖維素降解菌的篩選［J］. 西南師范大學學報：自然科學版, 2013, 38（3）：134-137.

［15］ 王大為, 王影, 遲燕平. 纖維素降解菌的分離篩選及酶活測定［J］. 食品工業(yè), 2013, 34（5）：219-221.

［16］ 曹軍衛(wèi), 馬輝文, 張甲耀. 微生物工程［M］. 第2版. 北京：科學出版社, 2007：92-113.

［17］ 許玉林, 鄭月霞, 葉冰瑩, 等. 一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定［J］. 微生物學通報, 2013, 40（2）：220-227.

［18］ 習興梅, 曾光明, 郁紅艷, 等. 黑曲霉Aspergillus niger木質(zhì)纖維素降解能力及產(chǎn)酶研究［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2007, 26（4）：1506-1511.

（責任編輯 李楠）

Analysis on Cellulase Producing Abilities of Three Kinds of Fungi and Optimization of Cultivation Conditions

Hu Cuiying Li Liangzhi Zhao Jian Qian Wei Gu Huajie
（College of Chemistry，Biology and Materials Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009）

We analyzed the cellulose degradation ability of three kinds of fungi （Penicillium, Mucor and Aspergillus） preserved in the laboratory and optimalized the culture conditions. The transparent ring size of three kinds of fungi training in the congo red medium and in the corncob congo red medium was observed. The cellulase activity was measured of the three fungi cultured in the CMC-Na medium. Single factor and response surface methodology were used to optimize the culture condition. The three kinds of fungi all could produce cellulase. The cellulase activity of Mucor was higher than the other two cultured in the the CMC-Na medium. The optimized conditions were below：pH was 5.0, the shaking speed was 220 r/min，fermentation time was 47 h，fermentation temperature was 35 ℃. The highest CMCase activity was 6.99 U/mL training on the optimized condition. Penicillium, Mucor and Aspergillus produced cellulase and Mucor could degrade corncob.

Fungi Cellulase Culture condition Optimize

2013-10-14

作者簡介：胡翠英，女，碩士，研究方向：發(fā)酵工程研究；E-mail：13151170848@163.com