馬鈴薯晚疫病防治的轉(zhuǎn)基因策略

馬鈴薯晚疫病防治的轉(zhuǎn)基因策略

肖歡歡 辛翠花 丁艷 朱佳莉 郭江波
（內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，包頭 014010）

晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的病害，是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的病害之一。采用傳統(tǒng)育種和化學(xué)農(nóng)藥等方法防治馬鈴薯晚疫病雖然早有研究，但至今收效甚微?；蚬こ碳夹g(shù)的興起為防治馬鈴薯晚疫病提供了新的契機(jī)，并已取得了一定成效。但單基因抗性容易喪失、水平抗性應(yīng)用難度大，要提高抗病基因的持久性，同時(shí)釋放多個(gè)抗病基因，人為提高田間抗病基因的多態(tài)性是目前可選途徑之一。對(duì)各種防治方法進(jìn)行了綜述，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建抗病基因近等混合系是持久防治馬鈴薯晚疫病的首選可行方法，概述了其發(fā)展前景。

馬鈴薯 晚疫病 抗病基因近等混合系

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界第三大糧食作物，栽培面積僅次于水稻和小麥。馬鈴薯糧菜兼用，生育期短，單位面積產(chǎn)量高，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量淀粉，優(yōu)質(zhì)蛋白，以及多種維生素和礦物質(zhì)。現(xiàn)在全球種植馬鈴薯的國(guó)家有148個(gè)，總產(chǎn)量達(dá)3×108t。馬鈴薯在食物安全系統(tǒng)中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，但耕地面積的減少，對(duì)馬鈴薯的生產(chǎn)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也是馬鈴薯發(fā)展的巨大機(jī)遇。國(guó)際馬鈴薯中心（CIP）的研究表明，在世界范圍內(nèi)對(duì)馬鈴薯的需求到2020年將有望增長(zhǎng)20%［1］。但馬鈴薯晚疫病嚴(yán)重限制了其產(chǎn)量和發(fā)展，本文就馬鈴薯晚疫病的各種防治方法進(jìn)行綜述，特別對(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建抗病基因近等混合系防治馬鈴薯晚疫病的方法進(jìn)行概述。

1 馬鈴薯晚疫病的危害

晚疫病是由致病疫霉菌（P.infestans）引起的，是引起馬鈴薯產(chǎn)量損失最嚴(yán)重的病害之一。馬鈴薯晚疫病大發(fā)生主要與病原菌基數(shù)、品種抗性、氣候因素、栽培模式等密切相關(guān)［2］。1847年由于晚疫病傳播引起的饑荒，使100多萬(wàn)愛(ài)爾蘭人死亡，200多萬(wàn)逃亡海外，史稱愛(ài)爾蘭大饑荒（The Great Irish

Famine）［3］。1996年，據(jù)國(guó)際馬鈴薯中心（CIP）估計(jì)，由于晚疫病的危害使馬鈴薯大量減產(chǎn)，在全球造成170億美元的損失。在我國(guó)，馬鈴薯生產(chǎn)也一直受到晚疫病的危害，特別在50年代到60年代初，華北、東北和西北曾幾次發(fā)生晚疫病大流行，使馬鈴薯生產(chǎn)損失過(guò)半［4］。因此，防治馬鈴薯晚疫病已成為當(dāng)今世界馬鈴薯生產(chǎn)和育種工作中的重中之重。

2 晚疫病的防治

晚疫病的發(fā)生易受氣候條件、種薯品種、田間管理等因素的影響［5］。針對(duì)其發(fā)病特點(diǎn)和生產(chǎn)方式，現(xiàn)在主要采用的防治技術(shù)有農(nóng)業(yè)技術(shù)、化學(xué)農(nóng)藥和培育抗病品種等。

加強(qiáng)田間管理、采用不同的播種期及種薯處理等農(nóng)業(yè)技術(shù)雖然在晚疫病的防治中確實(shí)有一定的作用，減輕了晚疫病的危害，但效果并不理想［6］。這些措施只能是預(yù)防，“治標(biāo)不治本”，不能從根本上防治馬鈴薯晚疫病，且工作量大，有時(shí)徒作無(wú)用功?；瘜W(xué)防治仍是目前控制晚疫病流行的主要措施。而致病疫霉菌生理小種進(jìn)化速度極快，單純靠除草劑、殺蟲(chóng)劑、銅制劑等化學(xué)藥劑來(lái)防治晚疫病很快就會(huì)使病菌產(chǎn)生抗藥性［5］，從而使病害再度流行，且會(huì)有藥害殘留。將不同的化學(xué)藥劑組合在一起防治晚疫病，確實(shí)取得了一定成效，但由于不同的地區(qū)間存在著致病力和抗藥性不同的生理小種，會(huì)大大增加選擇藥劑組合的難度和廣度，一旦病菌產(chǎn)生了抗藥性，前期工作就會(huì)前功盡棄。此外，化學(xué)農(nóng)藥易污染環(huán)境，成本也較貴，故其應(yīng)用推廣受到了限制。

因此，培育抗病品種就成了防治馬鈴薯晚疫病切實(shí)有效的方法。隨著20世紀(jì)抗病育種技術(shù)的發(fā)展，馬鈴薯抗晚疫病的遺傳研究取得了突破性進(jìn)展，育種工作者從野生馬鈴薯品種（Solanum demissum）中鑒定分離出了11個(gè)主效抗晚疫病基因（R1、R2、R3……R11），并利用基因滲入等方式將大多數(shù)抗性基因整合進(jìn)栽培品種中［7］。但晚疫病原菌具有混合的交配方式和高的基因流，屬于進(jìn)化潛力最高、風(fēng)險(xiǎn)最大、最易克服單一抗病性的病原菌之一［8］。馬鈴薯常規(guī)育種周期長(zhǎng)，且這些R基因都是由單基因控制的小種專一抗性，因而經(jīng)多年努力培育的抗病品種很容易被病原菌克服，抗病持久性弱。育種家試圖從其他野生種中尋找新的抗病基因或者利用水平抗性基因來(lái)實(shí)現(xiàn)持久抗性的目標(biāo)。但這種途徑也困難重重。有性雜交障礙和連鎖累贅使得從其他野生種中尋找抗病基因?qū)朐耘嗥贩N并育成商業(yè)品種非常困難［9］。

20世紀(jì)后期轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起為馬鈴薯晚疫病的防治工作提供了新的契機(jī)，從抗晚疫病的野生品種中分離出各種抗病基因，并將其轉(zhuǎn)入到目前栽培品種中的策略，成為目前獲得持久性抗晚疫病的最快捷的手段。

3 馬鈴薯抗晚疫病轉(zhuǎn)基因研究

近年來(lái)馬鈴薯抗晚疫病基因克隆取得了很大的進(jìn)展，已經(jīng)有來(lái)源于野生種S.demissum的R1和R3a及來(lái)源于S.bulbocastanum的RB和Rpi-blb2被克隆［10-13］，一些新的抗晚疫病基因被定位［14，15］、馬鈴薯基因組的測(cè)序［16］和抗病基因數(shù)據(jù)庫(kù)建立［17］為抗晚疫病的轉(zhuǎn)基因研究奠定了基礎(chǔ)。

馬鈴薯抗晚疫病的轉(zhuǎn)基因研究近年來(lái)也取得了一些效果。如Liu等［18］、Zhu等［19］和李汝剛等［20］分別報(bào)道了煙草Osmotin蛋白轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株可以推遲晚疫病病斑出現(xiàn)時(shí)間，降低P.infestans的浸染頻率，賦予葉片抗晚疫病的能力；李汝剛等［21］報(bào)道，Harpin基因的組成型表達(dá)和病源誘導(dǎo)表達(dá)均賦予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株抗晚疫病的能力；金紅等［22］將從非洲甜菊中分離出來(lái)的類甜蛋白基因（tlp）及其緊密連鎖的抗除草劑bar基因以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入馬鈴薯中，經(jīng)晚疫病菌游離孢子接種離體抗性分析，轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出對(duì)晚疫病的明顯抑制作用和癥狀發(fā)生的延遲作用；Wu等［23］報(bào)道葡萄糖氧化酶（go）基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中表達(dá)，降低了晚疫病菌對(duì)馬鈴薯的浸染速度；崔艷紅等［24］利用VIGS技術(shù)研究表明SGT1和HSP90是參與RB和R3a抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑過(guò)程中的關(guān)鍵基因，該技術(shù)體系的建立，為發(fā)現(xiàn)新晚疫病抗病相關(guān)基因的功能驗(yàn)證提供了一個(gè)高效的技術(shù)平臺(tái)；辛翠花等［25］通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將馬鈴薯的抗晚疫病基因R3a和R1分別導(dǎo)入馬鈴薯品種Desiree中，大多數(shù)轉(zhuǎn)R3a和R1基因的馬鈴薯對(duì)對(duì)應(yīng)菌株能夠產(chǎn)生抗性；黃先群等［26］將甜

椒中分離出來(lái)的一種過(guò)敏反應(yīng)促進(jìn)蛋白hrap基因?qū)腭R鈴薯品種“Burbank”中獲得了抗晚疫病植株。

這些方法獲得的抗性苗在一定程度上對(duì)晚疫病確實(shí)有一定的防治效果，但抗性不能持久，很容易被病原菌克服，從而使病害再度流行。在單基因抗性容易喪失、水平抗性應(yīng)用難度大的前提下，提高田間抗病基因的多態(tài)性是馬鈴薯抗晚疫病的可行策略之一。提高田間寄主抗性空間多樣性一般采用混合品種或近等混合系來(lái)實(shí)現(xiàn)［27］。但混合品種不僅抗性基因不同，而且可能熟性及薯塊的其他商品性狀也不同，混合品種法的推廣受到了限制。因而創(chuàng)建抗病基因近等混合系將是持久防治馬鈴薯晚疫病的有效新策略。由于馬鈴薯是基因組高度雜合的同源四倍體作物，有嚴(yán)重的自交衰退現(xiàn)象，無(wú)法通過(guò)回交的方法育成近等混合系。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)將是創(chuàng)建抗病基因近等混合系的必由之路。

4 田間創(chuàng)建抗病基因近等混合系的基礎(chǔ)

為進(jìn)一步提高田間抗病基因的多態(tài)性以確保近等混合系在防治馬鈴薯晚疫病上成功應(yīng)用，還需克隆更多的抗病基因。

Huang等［28］通過(guò)連鎖不平衡發(fā)現(xiàn)了一個(gè)等位多態(tài)性較高的抗晚疫病基因位點(diǎn)，從野生種S. demissum導(dǎo)入的11個(gè)主效基因中有8個(gè)（R3，R5-R11）來(lái)自于該位點(diǎn)。因此，把它命名為馬鈴薯抗晚疫病主效位點(diǎn)（Major late blight resistance complex，MLB）。馬鈴薯MLB和番茄的抗枯萎病位點(diǎn)I2是同源的，都位于第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂的末端，且都是復(fù)合抗病基因位點(diǎn)，因此R3、R5-R11被稱為MLB的單倍型（Haplotypes），而非經(jīng)典意義上的等位基因（Alleles）。通過(guò)比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MLB的R3單倍型有3個(gè)抗病基因簇，其中2個(gè)基因簇中有功能性的抗病基因，分別是R3a和R3b［29］。在這3個(gè)基因簇中發(fā)現(xiàn)的所有抗病基因類似物（40-60個(gè)）都是番茄I2基因的同源基因，并運(yùn)用比較基因組學(xué)的方法克隆了R3a基因。在DNA和蛋白質(zhì)水平上，I2和R3a分別有88%和83%的同一性，都屬于CCNBS-LRR（coiled-coil nucleotide-binding site leucinerich repeat，卷曲螺旋-核苷酸結(jié)合位點(diǎn)- 富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域）類抗病基因。通過(guò)比較基因組學(xué)的方法來(lái)快速挖掘MLB，將為通過(guò)基因工程改良的方法構(gòu)建抗病基因近等混合系，實(shí)現(xiàn)馬鈴薯田間抗晚疫病基因多態(tài)性提供原材料，從而達(dá)到馬鈴薯晚疫病的持久抗性。

5 展望

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在育種中的應(yīng)用為馬鈴薯抗晚疫病育種創(chuàng)造了許多優(yōu)良的抗病材料，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)生物安全性問(wèn)題也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。如果在獲得轉(zhuǎn)基因材料的同時(shí)能夠考慮到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)生態(tài)環(huán)境、食物及人類健康的影響，通過(guò)各種途徑獲得一些生物安全的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，并結(jié)合傳統(tǒng)常規(guī)育種，建立一個(gè)持久的綜合防治體系，真正服務(wù)于生產(chǎn)，為我國(guó)及世界馬鈴薯晚疫病的有效防治貢獻(xiàn)出一份微薄力量。

［1］ 新華網(wǎng).第五屆世界馬鈴薯大會(huì)通訊［EB/OL］.［ 2004-03-21］, http://news.xihuanet.com/newscenter/2004-03/25/comtent.1385160. html.

［2］ 何衛(wèi)蓉, 羅賢芝, 蔡道輝.馬鈴薯晚疫病大發(fā)生原因分析及綜合防治［J］.中國(guó)園藝文摘, 2013（3）：164-165.

［3］ 李先平, 何云昆, 趙志堅(jiān), 等.馬鈴薯晚疫病育種研究進(jìn)展［J］.中國(guó)馬鈴薯, 2001, 15（5）：290-294.

［4］ 彭昕琴, 刁文一, 霍妙娟, 等.馬鈴薯抗晚疫病轉(zhuǎn)基因的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007（7）：142-145.

［5］ 弓貴明, 姬青云.馬鈴薯晚疫病的危害、發(fā)病條件和防治措施［J］.種子科技, 2012（1）：46-47.

［6］ 趙中華, 朱杰華, 朱曉明.馬鈴薯晚疫病發(fā)生特點(diǎn)與防治對(duì)策［J］.中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2012（4）：16-17.

［7］ 徐建飛, 辛翠花, 黃三文.利用田間抗病基因近等混合系防治馬鈴薯晚疫?。跩］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2006, 8（4）：8-13.

［8］ Haas BJ, Kamoun S, Zody MC, et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans［J］. Nature, 2009, 461（7262）：393-398.

［9］ McDonald BA, Linde C. Pathogen population genetics, evolutionary potential and durable resistance［J］. Anun Rev Phytopathol, 2002, 40：349-379.

［10］ Ballvora A, Ercolano MR, Weiss J, et al. The R1 gene for potato resistance to late blight（Phytophthora infestans）belongs to the

leucine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes［J］.Plant J, 2002, 30：361-371.

［11］ Song JQ, Bradeen JM, Naess SK, et al. Gene RB cloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potato late blight［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100：9128-9133.

［12］ Huang S, van der Vossen EA, Kuang H, et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato［J］. Plant J, 2005, 42：251-261.

［13］ van der Vossen EA, Gros J, Sikkema A, et al. The Rpi-blb2 gene from Solanum bulbocastanum is a Mi-1 gene homolog conferring broad-spectrum late blight resistance in potato［J］.The Plant Journal, 2005, 44：208-222.

［14］ Jo KR, Arens M, Kim TY, et al. Mapping of the S.demissum late blight resistance gene R8 to a new locus on chromosome Ⅸ［J］. Appl Genet, 2011, 123（8）：1331-1340.

［15］ Sliwka J, Jakuczun H, Chmielarz M, et al. Late blight resistance gene from Solanum ruiz-ceballosii is located on potato chromosome X and linked to violet flower colour［J］. Theor Appl Genet, 2012, 124（2）：397-406.

［16］ Xu X, Pan S, Cheng S, et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato［J］. Nature, 2011, 475（7355）：189-195.

［17］ Vleeshouwers VG, Finkers R, Budding D, et al. SolR gene：an online database to explore disease resistance genes in tuber-bearing Solanum species［J］. BMC Plant Bilo, 2011, 11：116.

［18］ Liu D, Raghothama KG, Hasegawa PM, et al. Osmotion over expression in potato delays development of disease symptoms［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91：1888-1892.

［19］ Zhu BL, Chen TH, Li PH. Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotion-like protein［J］.Plant, 1996, 198：70-77.

［20］ 李汝剛, 伍寧豐, 范云六, 等.表達(dá)Osmotion蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對(duì)晚疫病的抗性分析［J］.生物工程學(xué)報(bào), 1999, 15（2）：135-139.

［21］ 李汝剛, 范云六.表達(dá)Harpin蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯降低晚疫病斑生長(zhǎng)率［J］.中國(guó)科學(xué), 1999, 2（1）：56-61.

［22］ 金紅, 岳東霞, 周良炎.利用類甜蛋白基因誘導(dǎo)表達(dá)提高馬鈴薯對(duì)晚疫病的抗性研究［J］.華北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2001, 16（1）：67-72.

［23］ Wu, Short BJ, Lawrence EB, et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants［J］. The Plant Cell, 1995, 7：1357-1368.

［24］ 崔艷紅, 賈芝琪, 李穎, 等.利用VIGS技術(shù)研究馬鈴薯抗晚疫病基因R3a和RB的信號(hào)傳導(dǎo)［J］.園藝學(xué)報(bào), 2009, 36（7）：997-1004.

［25］ 辛翠花, 李穎, 劉慶昌, 等.馬鈴薯抗晚疫病基因材料的獲得及活性氧清除酶系與抗病過(guò)程關(guān)系分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41（12）：4023-4029.

［26］ 黃先群, 蔣敏華, 陳堅(jiān), 等.轉(zhuǎn)Hrap基因馬鈴薯獲得晚疫病抗性研究［J］.分子植物育種, 2011, 9（2）：218-223.

［27］ 楊靜, 施竹鳳, 高東, 等.生物多樣性控制作物病害研究進(jìn)展［J］. 2012, 34（11）：1390-1398.

［28］ Huang S. Discovery and characterization of the major late blight resistance complex in potato［D］. Netherlands：Wageningen University Press, 2005.

［29］ Huang S, Vleeshouwers VG, Werij JS, et al. The R3 resistance to Phytophthora infestans in potato is conferred by two closely linked R genes with distinct specificities［J］.Molecular Plant Microbe Interact, 2004, 17（4）：428-435.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Strategy to Control Potato Late Blight by Transgenic Technology

Xiao Huanhuan Xin Cuihua Ding Yan Zhu Jiali Guo Jiangbo
（College of Mathematics, Physics and Biological engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010）

Potato late blight is caused by Phytophthora infestans, which is one of the most serious threats to potato production. In previous research, it proved that it was difficult to control potato late blight by conventional breeding and chemical pesticides. There will be a new opportunity to control potato late blight due to the rise of gene engineering technology, and some success has been achieved. In order to improve the durability of resistance genes, one of the promising solutions for late blight control is to release several R genes simultaneously and artificially create a resistance polymorphism in the field, such as R gene polyculture. Through the comparison of various control methods, the strategy of R gene polyculture by transgenic technology is the first feasible method for controlling potato late blight, and the feasibility and prospects of create R gene polyculture were summarized in the article.

Potato Llate blight R gene polyculture

2013-09-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260344），內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011BS0506，2012MS0301），內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（NJZZ11139），內(nèi)蒙古科技大學(xué)李保衛(wèi)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金，內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳“青年科技英才支持計(jì)劃”

肖歡歡，男，碩士研究生，研究方向：植物遺傳育種；E-mail：xiaohuan7867@126.com

郭江波，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：重金屬環(huán)境污染物的植物修復(fù)分子機(jī)制；E-mail：primersyn@sina.com