人轉錄因子hASH4的表達純化及其DNA結合活性

蘇琢磊 樓田甜 王遠東 季朝能

（復旦大學生命科學學院 遺傳學研究所，上海 200433）

人轉錄因子hASH4的表達純化及其DNA結合活性

蘇琢磊 樓田甜 王遠東 季朝能

（復旦大學生命科學學院 遺傳學研究所，上海 200433）

hASH4蛋白所屬的HLH轉錄因子家族在調(diào)節(jié)基因表達，調(diào)控細胞周期，決定細胞分化中起了重要作用。有研究表明hASH4蛋白可能與皮膚的分化發(fā)育有著密切的關系，但具體機制不明。成功構建了pET28b-hASH4表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達。經(jīng)過對溫度、時間、IPTG濃度等表達條件的優(yōu)化，確定在37℃下1 mmol/L IPTG誘導表達4 h可達到最佳表達效果，并通過親和層析和弱陽離子交換層析純化蛋白，得到了電泳純的目的蛋白。通過非放射性凝膠滯留試驗發(fā)現(xiàn)hASH4蛋白單體只具有非特異性的DNA結合活性，而不具有特異性的DNA結合活性，推進其在體內(nèi)的轉錄因子功能可能需先形成異源二聚體或多聚體才能進一步特異性結合DNA進而作用于下游基因。研究結果為hASH4蛋白的功能和作用方式提供了線索，并為其進一步的結晶條件篩選、晶體結構解析和功能研究奠定基礎。

螺旋-環(huán)-螺旋 堿性/螺旋-環(huán)-螺旋 hASH4 DNA結合 特異性結合 非特異性結合

螺旋-環(huán)-螺旋（Helix-Loop-Helix，HLH）轉錄因子家族是真核生物中非常重要的特異性轉錄因子家族，該家族廣泛存在于從酵母到人類的所有真核生物中，其成員在調(diào)節(jié)基因表達，調(diào)控細胞周期，決定細胞分化中起了重要作用［1，2］。大多數(shù)的HLH蛋白屬于堿性/螺旋-環(huán)-螺旋（basic/Helix-Loop-Helix，bHLH）家族成員，即有與HLH結構域相鄰的一個特殊堿性區(qū)，該堿性區(qū)多數(shù)可以與下游靶基因DNA的特異性序列包括E框基序（CANNTG）或N框基序（CACNAG）結合從而發(fā)揮轉錄激活或抑制作用，HLH結構域則主要負責介導蛋白的同源或異源二聚化，有利于DNA結合和轉錄調(diào)節(jié)［3-5］。

hASH4（Human achaete-scute homolog 4）基因是Jonsson等［6］最新克隆得到的一段基因，其位于人染色體12q24.1位置，編碼173個氨基酸，其蛋白結構含有bHLH（堿性/螺旋-環(huán)-螺旋）這一特殊結構域，是HLH轉錄因子家族的成員achaete-scute同系物的一員。在當前的研究報道中，hASH4蛋白的表達主要發(fā)現(xiàn)于人皮膚中，在其他器官如腦等只有十分微量的表達，而且在胎兒皮膚中蛋白的表達量是成人皮膚的7倍，固有研究認為hASH4蛋白與皮膚的分化發(fā)育有著密切的關系，但相對于HLH蛋白家族在神經(jīng)細胞發(fā)育中所起的作用的研究，其在皮膚發(fā)育中的研究還十分缺乏，并沒有嚴謹?shù)淖C據(jù)證明其如何調(diào)控或者影響著皮膚細胞的分化［6］。在已有的HLH家族蛋白功能研究報道中，我們發(fā)現(xiàn)很多HLH蛋白都在各自的表達區(qū)域起到非常重要的發(fā)育分化調(diào)控作用，且很多跟腫瘤的形成有密切關系，并有希望能作為腫瘤的治療靶點，如hASH1、Id4等［7-9］。而且對ASH家族的其他蛋白功能的研究也十分匱乏，hASH2和hASH3跟hASH4有相似的情況，均有可能在皮膚的發(fā)育分化中起到一定的作用［10］。本研究希望通過對hASH4的bHLH結構域進行體外克隆表達純化，探究其是否具有特異DNA結合框，為其在體內(nèi)可能的轉錄因子功能和作用機理提供線索，并為hASH4蛋白進一步的結晶條件篩選、晶體結構解析和功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人工合成基因hASH4；用于表達的質(zhì)粒pET28b、E.coliTop10感受態(tài)細胞及表達菌株BL21（DE3）為本實驗室保存；各種限制性內(nèi)切酶購自New England公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1hASH4基因的人工合成和酶切鑒定 依據(jù)GenBank中的hASH4基因序列，將hASH4基因中的稀有密碼子改造為大腸桿菌偏愛密碼子。人工合成hASH4基因，在合成基因的上下游分別設計NheⅠ和XhoⅠ酶切位點，構建重組表達載體pET28bhASH4，轉化至大腸桿菌E.coliTop 10感受態(tài)細胞中，在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)約14 h。挑取單克隆，菌落PCR鑒定正確后，提交Invitrogen公司測序。

1.2.2 hASH4蛋白的表達及誘導條件優(yōu)化 轉化鑒定正確的重組質(zhì)粒于表達菌株BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)12-14 h，挑取單菌落，轉接于100 mL的含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min培養(yǎng)3 h后，將其轉接到含50 μg/mL卡那霉素和34 μg/mL的氯霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37℃，200 r/min）至OD600值為0.6-0.8，加入1.0 mmol/L IPTG對比在誘導溫度為18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）下的誘導情況，確定最佳的誘導表達條件。

1.2.3 hASH4蛋白的純化

（1）使用親和層析柱（HisTrapTMHP）純化目的蛋白，其操作步驟如下：離心收集的菌體經(jīng)緩沖液（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）重懸浮，經(jīng)壓力破菌儀（循環(huán)2次）破菌，高速離心（15 000 r/min，25 min），收集上清液，加入到平衡后的HisTrap柱，用緩沖液洗滌至無蛋白流出后，使用含有50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液（50 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）洗脫非特異性吸附的雜蛋白，再用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（250 mmol/L咪唑，50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，1 mol/L NaCl，10%甘油，pH8.0）梯度洗脫目的蛋白。

（2）使用離子交換層析（HiTrapTMCM FF）進一步純化目的蛋白，其操作步驟如下：用20倍體積的Tris緩沖液（10 mmol/L Tris，5%甘油，pH8.0）稀釋從HisTrap柱上洗脫的目的蛋白，平衡弱陽離子交換柱，將稀釋的溶液加入柱中，用緩沖液洗滌至無蛋白流出后，使用含有1 mol/L NaCl的緩沖液（10 mmol/L Tris，5%甘油，1 mol/L NaCl，pH8.0）梯度洗脫目的蛋白。對純化得到的目的蛋白進行SDSPAGE分析并透析超濾保存。

1.2.4 hASH4與DNA結合活性的研究

（1）通過分子篩試驗確認純化所得蛋白的存在形式：收集離子交換層析的純化產(chǎn)物，經(jīng)過超濾濃縮至體積小于5 mL，通過微量注射器將蛋白純化產(chǎn)物加入到平衡后的分子篩，使用分子篩緩沖液

（10 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH8.0）持續(xù)流過洗柱。根據(jù)實驗室之前標定的分子篩分子量范圍，按時收取對稱的流出峰主峰。根據(jù)流出峰所在位置和流出峰為單峰或雙峰判斷蛋白存在形式。

（2）篩選是否有特異性DNA結合域：離心收集37℃下1.0 mmol/L IPTG誘導表達4 h的菌體，使用不含NaCl和甘油的緩沖液懸浮，并壓力破菌、高速離心收集上清液后，上樣到平衡后的HisTrap柱，用含有高濃度的NaCl和甘油的緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，進行DNA電泳，割膠回收一些較小片段的DNA，使用PCR酶進行酶切，并連接到T載體上，挑選陽性克隆，提交Invitrogen公司進行測序，鑒定所得DNA片段是否含有一些特異性結合位點。

（3）鑒定蛋白與poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）序列的結合活性：提交Invitrogen公司合成單鏈poly（dA）、poly（dT）、poly（dG）、poly（dC）序列，各有22個堿基，在Tris緩沖液體系中，poly（dA）與poly（dT）、poly（dG）與poly（dC）在94℃條件下變性5 min，52℃退火連接10 min，復性成雙鏈poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）DNA片段。在緩沖體系終濃度為50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl下混合DNA與蛋白，25℃溫育30 min通過2倍DNA電泳膠低電壓30 V（防止過熱導致蛋白變性）電泳檢測蛋白與DNA是否具有結合活性。

（4）合成含有已知的HLH結構域蛋白的DNA特異性結合框E-box（CANNTG）和N-box（CACNAG）的所有可能的序列片段，并在DNA兩端各加上8個AT堿基（保證具有超過20個堿基對，方便進行下一步的凝膠滯留試驗），外加對照組poly（dG）·poly（dC）片段，并如前面步驟復性成雙鏈DNA，所有序列如表1所示。

所有合成的DNA與蛋白在緩沖體系終濃度為50 mmol/L Tris，150 mmol/L KCl條件下按不同比例混合、25℃溫育30 min，各加入6×溴酚藍凝膠載樣緩沖液，然后上樣到8%非變性丙烯酰胺凝膠，在1×TBE染色液中穩(wěn)壓100 V 4℃低溫電泳，大約90 min后結束，收板，銀染顯色。根據(jù)是否出現(xiàn)DNA滯留片段判斷蛋白的DNA結合活性。

表 1 試驗中用到的雙鏈DNA序列

2 結果

2.1 hASH4的人工合成及重組質(zhì)粒的鑒定

生物信息學分析所得的hASH4的bHLH結構域氨基酸序列為：

按大腸桿菌的密碼子優(yōu)化并加上NheI和XhoI酶切位點的基因序列為：

利用人工合成方法合成hASH4基因，將hASH4基因連接到pET28b質(zhì)粒中，轉入E.coliTop10感受態(tài)細胞中，挑選單菌落進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至Invitrogen公司測序，測序結果與設計的hASH4序列完全一致。

2.2 hASH4蛋白的誘導表達條件優(yōu)化

用SDS-PAGE分析對比1.0 mmol/L IPTG條件下，在誘導溫度為18℃（12 h）、25℃（8 h）、37℃（4 h）中的誘導情況如圖 1所示。在37℃（4 h）誘導條件下，目的融合蛋白的可溶性表達量最高。目的融合

蛋白分子量約為9.1 kD，與圖中片段大小相符。 標準分子篩圖（圖 4），可以看出hASH4蛋白流出峰所在的緩沖液體積略大于溶菌酶，說明純化所得的蛋白分子量小于溶菌酶，且因為融合蛋白的單體分子量為9.1 kD，所以該蛋白是以單體形式存在。由于在純化過程中沒有加入DTT、β-巰基乙醇等試劑來抑制二硫鍵的作用影響二聚體的形成，說明該蛋白在體內(nèi)也較難有同源二聚體的形成。這為下一步的DNA結合活性研究提供了一定的線索。

圖 1 不同溫度誘導hASH4蛋白表達的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.3 hASH4蛋白的純化

由于融合蛋白pET28b- hASH4含有His標簽，可使用Ni-NTA親和柱純化表達產(chǎn)物，且融合蛋白PI值為9.73，所以選用弱陽性離子交換柱進行進一步純化，所得融合蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分析圖（圖 2）中可見得到一條約為10 kD左右的蛋白條帶，這與預期的蛋白分子量（9.1 kD）基本符合，且蛋白純度較高，基本無雜帶出現(xiàn)，并將所得蛋白用緩沖液透析，超濾至10 mg/mL，分裝并-80℃保存。

圖 2 純化過程所得蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.4 hASH4蛋白存在形式的研究

通過分子篩試驗確認蛋白是否有二聚體形成，從分子篩流程圖（圖 3）中可以看出，蛋白流出峰只有一個，說明蛋白只以一種形式（只有一種分子大?。┐嬖冢瑢φ諏嶒炇冶４娴娜芫福?4 kD）的

圖 3 目的融合蛋白過分子篩流程圖

圖 4 溶菌酶（14 kD）的標準分子篩圖

2.5 部分與蛋白結合的DNA序列比對

經(jīng)過將純化時洗脫的DNA進行克隆表達測序，得到一些小片段DNA的序列為：

（1）5'-TGTGCGAGCCAGCTCAAACTTTTTAACC TTTTTGTTTCAATTATGATCCAGGTACATTTCTGTGA TGTTGTCTGGGTGTTATTTTAAGGCCGCAGGTACCC CATAACCTTACAAGATCTGTGGTTTTACTAAAGGAC ACCCTATGAAAACCTCTA-3'。

（2）5'-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG ATGGTCATCGTCTTCTA-3'。

（3）5'-TAGACCTCGCCAATACTGTTCAGCAGG ATGTGTCGCTGGCCCTGTTTAATTTCCTGGAGCATTT CCCGTTCTCTTCTGTGCTGTCATTCATTGCAATGGCG ATGGTCATCGTCTTCTA-3'。

（4）5'-TTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG TTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATT TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTC CGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGT AAGCGTTAATATTTTGTTAAAAT-3'。

（5）5'-TCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTC ATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCC TTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGA GTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAA AGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACC GTCTATCAGGGCGA-3'。

（6）5'-TGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTA ACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGC TTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAA CAGGCAGACATA-3'。

（7）5'-TAGGAGCAGGAAACTGATGTACTGTTG ATTGGCGGCGGCATTATGAGCGCCACGTTGGGGAC CTATTTACGCGAGCTGGAGCCTGAATGGTCGATGAC CATGGTGGAGCGCCTGGAGGGTGTCGCGCAGGAGA GTTCGAACGGCTGGAA-3'。

如測序結果所示，經(jīng)過比對，只有4號片段中含有E-box（CANNTG）結合框，其沒有重復性高的DNA片段出現(xiàn)，所以猜測單體hASH4不一定具有特異性的DNA結合活性。所以下一步試驗直接合成最特異性的片段poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC），如果蛋白與這兩種DNA依然有結合，說明其具有一定的非特異性的結合活性。poly（dA）·poly（dT）和poly（dG）·poly（dC）在試驗方法1.2.4所述的體系下與蛋白反應，通過DNA凝膠電泳結果如圖 5所示，poly（dA）·poly（dT）序列和poly（dG）·poly（dC）序列與蛋白均有一定的結合活性，且poly（dG）·poly（dC）序列與蛋白的結合活性稍微強一些，所以猜測hASH4蛋白具有非特異性的DNA結合活性，而特異性則需要進一步驗證。

從已有研究得知hASH4蛋白所屬的bHLH轉錄因子家族的A組子家族，最常見的DNA結合框為CAGCTG其次為CACCTG。在下一輪試驗設計中，第一步采用poly（dG）·poly（dC）片段o號、帶有N-box的k號片段、帶有最常見的CAGCTG框的h號片段與蛋白互作。在對比DNA與蛋白比為1∶1、1∶3、1∶6的不同組別非變性丙烯酰胺凝膠電泳結果（圖 6），發(fā)現(xiàn)在較高蛋白比6∶1時3個片段均出現(xiàn)相同的DNA片段滯后現(xiàn)象，在3∶1組中也有非常微量的滯后條帶，說明蛋白與3種片段存在相同的結合活性，且蛋白與DNA結合不是按照1∶1的比例進行結合，如果為特異性結合，則一個蛋白能結合一個DNA雙鏈，說明蛋白與3種片段均為非特異性結合。

圖 5 蛋白與特異DNA互作的凝膠電泳圖

圖 6 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

第2步試驗，減少DNA量加大蛋白比（1∶6、1∶9、1∶12），并使用含有A組子家族中最大可能的2個DNA特異結合框CAGCTG與CACCTG的h號片段和i號片段以及對照的poly（dG）·poly（dC）與蛋白互作，從圖 7中可以看出，3種DNA片段與蛋白均有結合存在，且結合活性沒有明顯不同。

第3步試驗，使用所有合成的含有E-box

（CANNTG）以及N-box（CACNAG）DNA片段，在與蛋白比為1∶15的比例反應，并通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從圖 8發(fā)現(xiàn)所有泳道均有DNA滯后片段出現(xiàn)，其滯后片段相同，證明所有片段與蛋白都具有相同的結合活性。

圖 7 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖 8 雙鏈DNA與hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖9 雙鏈DNA與BSA蛋白和hASH4蛋白互作的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

在前3步試驗中，由于在非放射性凝膠滯留試驗中高濃度蛋白有可能表現(xiàn)出“粘性”，繼而顯現(xiàn)出非特異性結合DNA的性質(zhì)，所以采用實驗室保存的BSA溶菌酶蛋白以相同蛋白濃度并DNA蛋白比（1∶12、1∶15）作為對照組。從圖9中可以看出，BSA對照組（1號、2號條帶）中并沒有滯后的DNA片段出現(xiàn)，說明試驗中DNA滯后的現(xiàn)象的確是跟hASH4蛋白結合引起的。結合前面的凝膠滯留試驗結果，研究認為hASH4蛋白單體并不存在有特異性的DNA結合活性，只具有非特異性結合活性。

3 討論

本研究中先期試驗得到的與hASH4蛋白結合的DNA片段測序結果顯示并沒有存在已知的HLH轉錄因子家族所有特異性結合框，且發(fā)現(xiàn)蛋白與poly（dG）·poly（dC）和poly（dA）·poly（dT）這種非常特異的DNA都具有結合，固猜測其并沒有特異性結合DNA現(xiàn)象存在。所以在進一步的試驗設計中就采用較為簡單的DNA凝膠電泳和非放射性凝膠滯留試驗來定性證明這一猜測。如果發(fā)現(xiàn)其存在著特異性的DNA結合活性，則需要放射性的EMSA試驗來定性和定量證明蛋白特異性DNA結合活性的強弱，雖然也有研究直接通過非放射性的凝膠滯留試驗驗證蛋白的特異性的DNA結合活性，但我們認為該試驗方法并不嚴謹，可能只能定性地說明蛋白具有特異性結合活性，但并不能定量的證明［11，12］。

從試驗結果中發(fā)現(xiàn)hASH4雖然屬于HLH轉錄因子家族A子家族，卻不具有特異性的DNA結合活性，且通過分子篩試驗證明hASH4蛋白在體外以單體形式存在，不形成同源二聚體，這證明該蛋白在體內(nèi)一般也不會形成同源二聚體。所以猜測hASH4蛋白可能需先形成異源二聚體或多聚體才能進一步特異性結合DNA而作用于下游基因并發(fā)揮轉錄因子的功能，這種現(xiàn)象在HLH轉錄因子家族中普遍存在，如Max［13］、E47［14］蛋白家族等。要證明這個猜測則需要在進一步研究進行驗證。由于hASH4蛋白于幼兒皮膚中大量表達存在，其功能應該與皮膚發(fā)育有關，進一步的研究可以嘗試找到已知的在皮膚分化發(fā)育中起到重要作用特別是也在幼兒皮膚大量表達的HLH轉錄因子或其他結構域轉錄因子，與hASH4蛋白相互作用研究是否存在共同作用，若存在共同作用，則進一步證明其復合物是否具有特異性的DNA結合活性。若無法找到也在皮膚中大量表

達的蛋白，則可以通過與已知的一些重要的HLH轉錄因子相互作用，已有研究表明存在部分HLH轉錄因子在多個器官可以與不同的HLH轉錄因子蛋白結合形成異源二聚體而發(fā)揮功能作用，若找到可以與hASH4蛋白相互作用的蛋白，可能會給其在體內(nèi)所起的功能和作用機制提供線索。

本研究采用的是原核表達系統(tǒng)對hASH4蛋白進行表達純化，所得蛋白的翻譯后修飾狀態(tài)可能與細胞內(nèi)存在一定的不同，從而影響其與DNA的結合。在已有的對該家族同組別蛋白的研究中，多數(shù)均采用原核表達系統(tǒng)，例如MyoD、Max、E蛋白、PHO等蛋白家族［1，13-18］，通過原核表達報道了完整的蛋白晶體以及蛋白和DNA結合的晶體。本研究中hASH4蛋白能非特異性的結合DNA說明原核表達的hASH4蛋白具有預測性的DNA結合活性，只是這種非特異性結合DNA的性質(zhì)是否真正代表細胞內(nèi)該蛋白的特性還有待進一步的研究和確認。

通過原核表達得到的真核生物轉錄因子蛋白單體的低溶解度和不穩(wěn)定性導致其晶體結構的不易獲取，所以對HLH蛋白晶體結構解析的研究大多集中于蛋白與DNA復合結構或蛋白二聚體與DNA的復合結構，PDB數(shù)據(jù)庫上對HLH蛋白單體的結構數(shù)據(jù)較少，大部分為復合結構數(shù)據(jù)［1，13，15-18］。因此在對HLH轉錄因子蛋白結構和功能的研究中，其單體與DNA是否存在特異性結合活性是第一步需要得到驗證的，本研究所采用的方法較為簡單快捷，可以較好地在HLH轉錄因子家族的結構功能研究中得到推廣。

4 結論

本研究成功構建了hASH4的表達純化系統(tǒng)，通過 pET28b- hASH4 重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，原核表達得到可溶性融合蛋白，及電泳純化目的蛋白。hASH4蛋白單體不存在特異性的DNA結合活性，只存在非特異性結合活性。

［1］ Ma PC, Rould MA, et al. Crystal structure of MyoD bHLH domain-DNA complex：perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation［J］. Cell, 1994, 77（3）：451-459.

［2］ 王勇, 陳克平, 姚勤. bHLH 轉錄因子家族研究進展［J］. 遺傳, 2008, 30（7）：821-830.

［3］ Hajime O, Haruki O, et al. Transcription factors involved in lens development from the preplacodal ectoderm［J］. Eev Biol, 2012, 363（2）：333-347.

［4］ Massari ME, Murre C. Helix-loop-helix proteins：regulators of transcription in eucaryotic organisms ［J］. Mol Cell Bio, 2000, 20（2）：429-440．

［5］ Jones S. An overview of the basic helix-loop-helix proteins ［J］. Genome Biol, 2004, 5（6）：226-231．

［6］ Jonsson M, Mark EB, Brantsing C, et al. Hash4, a novel human achaete-scute homologue found in fetal skin［J］. Genomics, 2004, 84（5）：859-866.

［7］ Michael F, Ralf M, Andreas S, et al. Translational regulation of the human achaete-scute homologue-1 by fragile X mental retardation Protein［J］. J Biol Chem, 2009, 284（7）：4244-4266.

［10］ Miyamoto T, Hasuike S, Jinno Y, et al. The human ASCL2 gene escaping genomic imprinting and its expression pattern［J］. J Assist Reprod Genet, 2002, 19（5）：240-244.

［11］ Huang B, Liu JY. Prokaryotic expression and purification of a cotton dehydration responsive element binding protein GhDBPl and its DNA binding activity［J］. Prog Biochem Biophys, 2006, 33（3）：247-253.

［12］ Huang W, Wu QY. The ManR specifically binds to the promoter of a Nramp transporter gene inAnabaenasp. PCC 7120：a novel regulatory DNA motif in cyanobacteria［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 317（2）：578-585.

［13］ Nair SK, Burley SK. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA.Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors［J］. Cell, 2003, 112（2）：193-205.

［14］ Antonella L, Gerald PG, et al. Crystal structure of E47-NeuroD1 beta2 bHLH domain-DNA complex：heterodimer selectivity and DNA recognition［J］. Biochemistry, 2008, 47（1）：218-229.

［18］ Sauv S, Tremblay L, Lavigne P. The NMR solution structure of a mutant of the Max b/HLH/LZ free of DNA：insights into the specific and reversible DNA binding mechanism of dimeric transcription factors［J］. J Mol Biol, 2004, 342（3）：813-832.

（責任編輯 李楠）

Expression，Purification and DNA Binding Activity of Human Transcription Factor hASH4

Su Zhuolei Lou Tiantian Wang Yuandong Ji Chaoneng
（Institute of Genetics，School of Life Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433）

hASH4 is a member of Helix-Loop-Helix（HLH）proteins which are an important group of transcription factors that exert such a determinative influence on a variety of cell proliferation, determination and differentiation from yeast to human. hASH4 has been reported closely related to skin differentiation and development, but the exact mechanism is unknown. In this study, the expression plasmid of pET28bhis- hASH4 was restructured and successfully expressed in BL21（DE3）. After the optimization of temperature, time, IPTG concentration of expression, we ascertain that 1mmol/L IPTG expressed 4 hours at 37℃ can get the best expression. and we got the electrophoretic purity of the target protein by Ni-NTA affinity chromatography and ion cation exchange chromatography. The non-radioactive EMSA experiment between DNA and protein showed that the hASH4 protein only has the non-sepcific DNA binding activity without specific DNA binding activity. The play of transcription factors by hASH4 in the body may be need to form a heterodimer or multimer to further specific binding to DNA and act on the downstream genes. This study provided clues for the really function in vivo of hASH4 and laid the foundation for the further crystallization conditions screening, structural analysis and functional studies.

HLH bHLH hASH4 DNA-binding Specific binding Non-specific binding

2014-04-30

國家自然科學基金項目（30770427），“973”課題（2009CB825505）

蘇琢磊，男，碩士研究生，研究方向：分子遺傳與結構生物學；E-mail：suzhuolei@gmail.com

季朝能，男，博士，教授，研究方向：分子遺傳與結構生物學；E-mail：chnji@fudan.edu.cn