細菌脂肪酶在大腸桿菌細胞表面的功能性展示

徐麗香 王作鎮(zhèn) 舒正玉 武海龍 劉艷如 李欣 黃建忠

（1. 福建師范大學工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350108；2. 福建師范大學教育部工業(yè)微生物工程中心，福州 350108；3. 福建師范大學生命科學學院，福州 350108）

細菌脂肪酶在大腸桿菌細胞表面的功能性展示

徐麗香 王作鎮(zhèn) 舒正玉 武海龍 劉艷如 李欣 黃建忠

（1. 福建師范大學工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350108；2. 福建師范大學教育部工業(yè)微生物工程中心，福州 350108；3. 福建師范大學生命科學學院，福州 350108）

細胞表面展示技術已廣泛應用于突變文庫的高通量篩選，有力地促進了蛋白質工程的發(fā)展。以來自于銅綠假單胞菌的自轉運蛋白Est A的羧基端結構域作為錨定區(qū)，構建脂肪酶LipA與EstA羧基端結構域的融合基因，并將融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表達載體中，獲得表面展示載體pBCCB-X1。將載體pBCCB-X1分別導入到大腸桿菌JK321和大腸桿菌UT5600菌株中，以IPTG誘導融合基因的表達。分別用三丁酸甘油酯定性檢測和pNPO定量檢測誘導表達后的全細胞脂肪酶的水解活性。試驗結果表明，脂肪酶LipA在大腸桿菌JK321和大腸桿菌UT5600細胞表面均得到功能性展示，水解活性分別為（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。脂肪酶LipA在大腸桿菌細胞表面的功能性展示，為后續(xù)高通量篩選LipA突變基因文庫，奠定了堅實的基礎。

大腸桿菌 細胞表面展示 脂肪酶A 枯草芽胞桿菌

脂肪酶，又稱三酰甘油酯水解酶（Triacylglycerol lipase，EC3.1.1.3），能有效地催化各種底物的酯解反應。作為一種非水相酶，脂肪酶在各種有機體系（無水體系或微水體系）中，還能高效催化醇解反應、氨解反應及轉酯反應等多種反應。作為一種重要的工業(yè)生物催化劑，脂肪酶已被廣泛應用于食品工業(yè)、去污劑、油脂深加工、手性藥物合成等領域［1，2］。

在已知的各種脂肪酶資源中，來自于枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）的脂肪酶LipA具有獨特的結構特點和催化活性，已引起學界和業(yè)界的廣泛關注。該脂肪酶的3D結構不具有大多數微生物脂肪酶結構所具有的蓋子結構域（Lid domain），因此并

不表現(xiàn)出大多數脂肪酶所具有的界面激活（Interfacial activation）的催化特性［3］；在其3D結構中，也沒有二硫鍵，因此耐受各類氧化劑的能力較其他脂肪酶更高。近年來，盡管利用蛋白質工程技術改造枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA已獲得巨大的成功［4］，但依然存在許多技術性障礙。例如，如何建立枯草芽胞桿菌的高效轉化體系［5，6］，如何對突變基因文庫實現(xiàn)高通量篩選等問題，制約了對該脂肪酶的進一步深入分子改造。

細胞表面展示技術（Cell surface display）是利用運載蛋白，將靶蛋白展示在宿主細胞表面的蛋白質技術?；诩毎砻嬲故炯夹g發(fā)展出的熒光激活細胞分選法（Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）等超高通量篩選技術，已成功應用于對酶分子定向突變進化文庫的篩選工作，并取得良好的效果［7，8］。在已發(fā)展出的各種細胞表面展示系統(tǒng)中，大腸桿菌（Escherichia coli）細胞表面展示系統(tǒng)，因其遺傳背景清晰，遺傳操作簡單，因此成為各種靶蛋白展示的首選展示系統(tǒng)。到目前為止，來自于熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）脂肪酶、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）脂肪酶、南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶B等已在大腸桿菌細胞表面實現(xiàn)功能性展示［9-11］。如何實現(xiàn)具有較大分子量的酶分子的高效功能性展示及共展示不同酶分子，獲得具有多種催化活性的全細胞催化劑，從而將多步催化反應偶聯(lián)起來，是大腸桿菌細胞表面展示系統(tǒng)研究的熱點［12-14］。本研究以來自于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的自轉運蛋白Est A作為運載蛋白，成功地將枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA展示到大腸桿菌細胞的表面，為后續(xù)利用蛋白質工程技術改造在脂肪酶LipA奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗中使用及構建的質粒及菌株見表1。質粒pMD18-T simple、各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA marker及LA Taq DNA聚合酶等購自大連TaKaRa寶生物公司；SanPrep質粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；各類抗生素購自鼎國昌盛生物技術有限責任公司（福州），其使用濃度分別為：氨芐青霉素，40 μg/mL；氯霉素，50 μg/mL；三丁酸甘油酯購自國藥公司；對硝基苯酚辛酸酯（4-Nitrophenyl octanoate，pNPO）購自 Sigma 公司；其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

表1 本試驗使用的菌株及質粒

1.2 方法

1.2.1 細胞表面展示質粒pBCMB-X1的構建 用于大腸桿菌細胞表面功能性展示枯草芽胞桿菌胞外脂肪酶LipA的重組質粒pBCMB-X1的構建流程，如圖1。構建該重組質粒使用的引物、引物的Tm值及其攜帶的限制性內切酶識別位點，見表2。試驗過程中，PCR擴增反應使用的引物、模板、PCR擴增條件及其擴增產物大小，見表3。具體構建過程如下：以質粒pUC19為模板，以lacZ PF和lacZ PR為引物對，PCR擴增lacZ的啟動子。PCR擴增條件及擴增產物大小，見表3。PCR擴增產物和質粒pACYCDuet分

別用限制性內切酶EcoNⅠ和NcoⅠ酶切。酶切產物純化后，用T4DNA連接酶連接；連接產物轉化E. coliDH5α；以氯霉素抗性平板篩選轉化子，抽提并酶切驗證重組質粒pBCMB-W1。驗證后的重組質粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，進一步驗證該質粒的正確性。

圖1 細胞表面展示質粒pBCMB-X1構建流程圖

表2 本試驗中使用的PCR引物

表3 本試驗PCR擴增條件及其產物

以枯草芽胞桿菌的基因組為模板，以lipA CF和lipA CR為引物對，PCR擴增lipA基因。PCR擴增條件及擴增產物大小，見表3。PCR擴增產物純化后，克隆到pMD18-T Simple中，轉化E. coliDH5α。以氨芐青霉素篩選轉化子，抽提并PCR驗證重組質粒pMD18-T-lipA。驗證后的重組質粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

本課題組先前已克隆完整的銅綠假單胞菌自轉運蛋白EstA編碼基因（NCBI核酸數據庫登錄號為JN601114）。以銅綠假單胞菌AFU01菌株基因組DNA為模板，以estA EF / estA ER為引物對，PCR擴增estA'基因片段。PCR擴增條件及擴增產物大小，見表3。

先以枯草芽胞桿菌的基因組為模板，以lipA EF和lipA ER為引物對，PCR擴增lipA基因。PCR擴增條件及擴增產物大小，見表3。純化后的PCR擴增產物lipA與estA'片段按照一定的比例混合，并以此混合物為模板，以lipA EF / estA ER為引物對，PCR擴增lipA-estA'融合基因片段。PCR擴增條件及擴增產物大小，見表3。

分別用限制性內切酶BamHⅠ和Hind III對lipA-estA'融合基因片段及質粒pBCMB-W1進行酶切。純化后的酶切產物再按一定的比例混合，用T4DNA連接酶連接。連接產物轉化E. coliDH5α。以氯霉素抗性平板篩選轉化子，抽提并酶切驗證、PCR驗證重組質粒pBCMB-X1。驗證后的重組質粒pBCMB-X1進一步送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.2 脂肪酶lipA的誘導表達 將測序驗證正確的重組質粒pBCMB-X1和pBCMB-W1分別轉化到大腸桿菌E. coliJK321和E.coliUT5600菌株中，氯霉素抗性平板篩選轉化子。37℃過夜培養(yǎng)，從平板上分別挑取單菌落接種于含有50 μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)物菌體密度OD600達到0.6時，向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L。30℃ 200 r/min誘導lipA基因表達。12 h后4 000 r/min離心培養(yǎng)物，去掉上清，收集菌體。菌體再用20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.4）洗滌2次，并重懸在相同的緩沖溶液中，4℃保存。1.2.3 細胞表面展示脂肪酶酶活的定性與定量測定 細胞表面展示脂肪酶酶活的平板定性檢測方法參照Hiol 等［16］的平板檢測方法并略作修改。用于定性檢測的LB固體培養(yǎng)基中同時添加有1 mmol/L IPTG，50 μg/mL 氯霉素和3%（V/W）的三丁酸甘油酯乳化液。分別將4種轉化子E. coliJK321-pBCMBX1、E. coliJK321-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-X1的單菌落點接到定性檢測平板上，37℃培養(yǎng)2 d后觀察水解圈的產生情況。

細胞表面展示脂肪酶酶活的定量測定采用比色法，參照Kordel 等［17］的檢測方法，并略作修改。首先分別測定材料與方法1.2.2部分收集的菌懸液的OD600值。然后取150 μL菌懸液加入到2 820 μL 20 mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液中，同時向反應體系中加入30 μL 2.5 mmol/L的對硝基苯辛酸酯。37℃反應5 min后，離心收集上清液，測定其OD410值。酶活單位定義為：在該反應條件下，每分鐘釋放出1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量（OD600）作為1個酶活單位（U/OD600）。

2 結果

2.1 枯草芽胞桿菌脂肪酶基因的克隆與序列分析

從枯草芽胞桿菌YU01菌株克隆出的脂肪酶lipA基因，已提交NCBI核酸數據庫，登錄號為JX048066。該基因全長為639 bp，編碼212個氨基酸殘基。與其他已得到功能驗證或結構解析的枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA（如圖2中1I6W，2QXT和1T4M等）具有高度的同源性。比對結果（圖2）表明，Ser108、Asp164和His187構成了LipA的催化三聯(lián)體，并且Ser108位于保守五肽（Ala-His-Ser-Met-Gly）中。

2.2 枯草芽胞桿菌脂肪酶表面展示載體的構建

構建完成后的細胞表面展示載體pBCMB-X1質粒結構，如圖3-A。較初始質粒pACYCDuet而言，pBCMB-X1質粒的啟動子變更為lacZ啟動子，同時在其多克隆位點MCS1處插入了lipA與estA'的融合基因。啟動子調控區(qū)、靶蛋白、運載蛋白編碼區(qū)測序結果， 如圖3-B。 測序結果表明， 編碼區(qū)序列正確。

2.3 細胞表面展示脂肪酶酶活的測定

細胞表面展示脂肪酶定性檢測結果，如圖4-A。攜帶有融合基因的E. coliUT5600-pBCMB-X1（菌

落3）和E. coliJK321-pBCMB-X1（菌落4）較對照菌株E. coliUT5600-pBCMB-W1（菌落1）和E. coliJK-321-pBCMB-W1（菌落2）而言，菌落周圍有明顯的水解圈，表明該菌株能產生具有活性的脂肪酶。進一步利用對硝基苯酚辛酸酯作為底物進行定性測定結果表明，E. coliJK321-pBCMB-X1和E. coliUT5600-pBCMB-X1的酶活分別為（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。

圖2 枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA的氨基酸序列與其他LipA的氨基酸序列比對

圖3 細胞表面展示載體pBCMB-X1結構示意圖（A）及其序列分析圖（B）

圖4 細胞表面展示脂肪酶酶活的定性分析（A）及定量測定（B）

3 討論

本研究通過改造低拷貝數質粒pACYCDuet成功實現(xiàn)枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA在大腸桿菌細胞表面的功能性展示。在前期試驗中，我們曾嘗試利用pHSG398功能性展示LipA，但試驗未能成功，推測pHSG398為pMB1復制子，該質粒為高拷貝數質粒，而外源靶蛋白的大量表達對受體菌的生長可能具有一定的消極影響，從而導致表面展示試驗的失?。?8］。在后續(xù)試驗中，我們選用低拷貝數的pACYCDuet質粒（復制子為P15A）作為原始出發(fā)質粒，構建細胞表面展示載體。然而，pACYCDuet質粒使用T7啟動子，為強誘導型啟動子，因此在展示靶蛋白LipA之前，先將pACYCDuet質粒第一個多克隆位點的啟動子置換為lacZ啟動子。試驗結果表明，通過降低質?？截悢担瑔⒂萌鯁幼拥韧緩浇档桶械鞍椎谋磉_量，從而實現(xiàn)靶蛋白功能性展示的工作是必要的。

運載蛋白也是影響靶蛋白功能性展示的一個重要因子。本研究選用來自于銅綠假單胞菌的EstA蛋白的羧基端結構域作為錨定靶蛋白的運載蛋白。EstA是定位于細胞外膜并有部分結構域伸展到胞外的自轉運蛋白（Autotransporter），其羧基末端具有12個β-折疊形成的β-桶狀結構，插入到細胞膜的外膜，形成一個分泌通道［19，20］?；贓stA蛋白的羧基端結構域作為錨定蛋白構建的細胞表面展示系統(tǒng)，已有諸多成功報道［14，21，22］。本試驗正是基于這些成功實驗結果，直接選用羧基端的β1-β8作為錨定區(qū)，實現(xiàn)了LipA的高效功能性表面展示［21］。

受體菌是影響靶蛋白功能性展示的另一個重要因子。本研究比較了E. coliUT5600和E. coliJK321對靶蛋白實現(xiàn)功能性表面展示的影響。試驗結果表明，上述兩個受體菌展示的LipA的水解活性，未見顯著性差異。受體菌E. coliUT5600和E. coliJK321兩者之間的唯一差異在于：在E. coliJK321菌株中，影響蛋白質二硫鍵形成的dsbA基因因插入失活［15］。而本試驗被展示的靶蛋白LipA三級結構中，不存在二硫鍵，推測這是兩個受體菌水解活性沒有顯著性差異的主要原因。

本研究首次報道利用改造后的共展示載體pACYCDuet，在其第一個多克隆位點（MCS1），插入脂肪酶編碼基因與自轉運蛋白EstA羧基端編碼區(qū)的融合基因，成功實現(xiàn)脂肪酶A在大腸桿菌細胞表面的功能性展示。為后續(xù)在載體的第2個多克隆位點（MCS2）插入其他酶基因（如Amidase，氨解酶）并實現(xiàn)脂肪酶與氨解酶共展示，從而將酯解和氨解兩個過程偶聯(lián)起來，提高手性銨對映體的拆分。

4 結論

本研究以E. coliJK321和E. coliUT5600作為受體菌株，以自轉運蛋白Est A的羧基端結構域作為錨定區(qū)，利用脂肪酶LipA自身的信號肽介導融合蛋白（脂肪酶與Est A羧基端融合）的分泌，成功地將枯草芽胞桿菌的脂肪酶LipA功能性地展示到受體菌株的表面。展示有脂肪酶LipA的全細胞E. coliJK321和E. coliUT5600對底物對硝基苯酚辛酸酯的水解活性分別為（2.8±0.1）U/OD和 （2.6±0.06）U/OD。

致謝：

感謝西班牙國家生物技術中心的de Lorenzo Víc-

tor 教授及Fernández Luis Angel博士慷慨饋贈本試驗使用的E. coliUT5600和E. coliJK321菌株。

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（責任編輯 李楠）

Display of Functionally Active Lipases on the Escherichia coli Cell Surface

Xu Lixiang Wang Zuozhen Shu Zhengyu Wu Hailong Liu Yanru Li Xin Huang Jianzhong
（1. National & Local United Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108；2. Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108；3. College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108）

Cell-surface display technology was used widely in the filed of high throughput screening of a mutant library, which promoted the development of protein engineering. The carboxyl terminal domain of the EstA from Pseudomonas aeruginosa was used as carrier protein and the lipA gene was fused to the estA’ gene by overlap extension PCR. The fusion gene lipA-estA’ was then inserted the genetically modified plasmid pACYC-Duet, which promoter was changed into lacZ promoter. The resulting plasmid pBCMB-X1 was transformed into E. coli JK321 and E. coli UT5600, respectively. The lipA gene was induced expression by IPTG and the recombinant LipA was functionally displayed on the cell surface of E. coli JK321 and E. coli.UT5600, respectively. The hydrolysis activity of the LipA was（2.8±0.1）U/OD and（2.6±0.06）U/ OD, respectively.

Escherichia coli Cell surface display Lipase A Bacillus subtilis

2014-02-12

國家自然科學基金項目（31370802），福建省科技廳重點項目（2013H0021），福建省自然科學基金杰青項目（2009J06013）

徐麗香，女，研究方向：酶工程；E-mail：897787452@qq.com；王作鎮(zhèn)同為本文第一作者

舒正玉，男，博士，副教授，研究方向：酶工程；E-mail：shuzhengyu@gmail.com黃建忠，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)生物技術；E-mail：hjz@fjnu.edu.cn