蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)的免疫活性

羅 杰，黃朝翔，賀曉玉，牟 超，榮 茜，李英倫

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系，四川雅安625014）

蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)的免疫活性

羅 杰，黃朝翔，賀曉玉，牟 超，榮 茜，李英倫*

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系，四川雅安625014）

為了研究蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)的免疫活性，選擇28日齡“杜×長×大”斷奶仔豬90頭，隨機分為空白對照組（基礎(chǔ)日糧）、陽性對照組（基礎(chǔ)日糧添加0.5%的五味子）和實驗組（基礎(chǔ)日糧添加0.2%的蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)），每組3個重復。實驗期21d。每周從每個重復中隨機選取1頭，流式細胞儀檢測脾臟T淋巴細胞亞群分類，CCK-8法檢測脾臟淋巴細胞增殖活性，ELISA檢測血清中IgA、IgG和IgM含量。結(jié)果表明：陽性對照和實驗組脾臟CD3+、CD3+CD4+百分率，CD4+/CD8+比值在1～3周均高于空白對照組（p＜0.05或p＜0.01）；脾臟淋巴細胞增殖指數(shù)顯著提高（p＜0.01），血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量升高。實驗表明：五味子藥渣經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵后能提高仔豬的免疫功能。

五味子藥渣，蛹蟲草菌，發(fā)酵，免疫活性

應激綜合征是導致機體免疫功能低下，誘發(fā)多種疾病的根源之一。因此，在仔豬斷奶階段提高免疫力，降低應激反應，減少疾病的發(fā)生具有重要意義。中藥提取過程中產(chǎn)生了大量藥渣，五味子藥渣就是生脈注射液制備過程中殘留的藥渣之一。這些藥渣或被廢棄，或經(jīng)粗加工用作農(nóng)業(yè)肥料和添加于動物飼料中。廢棄藥渣既污染環(huán)境又浪費中藥資源；而粗加工藥渣由于活性物質(zhì)可利用量少、制備工藝粗糙，生物活性很低。據(jù)報道[1-3]，中藥渣經(jīng)有益微生物發(fā)酵，受微生物酶的影響而改變自身組織、成分，產(chǎn)生新的性味功能，還可能產(chǎn)生新的有效物質(zhì)。已有文獻[4-5]證實五味子（Schisandra Chinensis）具有增強免疫、降低發(fā)病率的作用，但未見五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)免疫活性的報道。本實驗以斷奶仔豬為對象，以中藥五味子為陽性對照，探討利用蛹蟲草菌（C.militaris）發(fā)酵五味子藥渣后的菌質(zhì)對仔豬免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草真菌（C.militaris） 購自中科院微生物研究所；五味子藥渣 雅安三九藥業(yè)惠贈（生脈注射液制備中五味子提取后殘渣）；北五味子（Schisandra Chinensis） 購自雅安西康藥業(yè)公司；刀豆蛋白A（Con A） Sigma公司；Cell counting kit-8 日本同仁化學研究所；胎牛血清 Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)液 Hyclone公司；單克隆抗體 Southern Biotech公司；其他試劑 為國產(chǎn)分析純；96孔培養(yǎng)板 Costar公司。

KDC-2046型低速冷凍離心機 中佳公司；Thermo Forma 311型CO2培養(yǎng)箱 Thermo Labsystems公司；酶聯(lián)免疫檢測儀 Bio-Rad公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZS-H型恒溫水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；SPX型生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；ECLIPSE TS100-F型倒置顯微鏡 Nikon公司；流式細胞儀（FACSCalibur）BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛹蟲草菌發(fā)酵藥渣的制備 將蛹蟲草真菌接種于土豆培養(yǎng)基上復壯6d；在裝有200mL菌種營養(yǎng)液的500mL三角瓶中無菌接入2塊蛹蟲草菌斜面菌種，120r/min搖床培養(yǎng)6d，形成均勻菌球；將五味子藥渣基質(zhì)與水在發(fā)酵瓶中攪拌均勻，經(jīng)121℃滅菌30min降至室溫后無菌接入4mL搖瓶菌種，靜置于生化培養(yǎng)箱中22℃發(fā)酵15d。發(fā)酵結(jié)束后將藥渣菌質(zhì)及五味子在40～50℃烘箱中干燥，粉碎過60目。

1.2.2 實驗動物分組及飼糧 將90頭28日齡“杜×長×大”斷奶仔豬隨機分為3組，每組3個重復，每個重復10頭?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)日糧，陽性對照組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%的五味子（參照藥典），實驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%的蛹蟲草發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)。按常規(guī)飼養(yǎng)管理程序飼養(yǎng)，預試期3d，正試期3周。飼喂方法采用群飼，每日定時喂料3次，自由飲水，保持圈內(nèi)清潔。

基礎(chǔ)飼糧參照美國NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要設(shè)計，配制成全價粉狀料，其組成及營養(yǎng)水平如下?；A(chǔ)飼糧由玉米41.18%、發(fā)酵豆粕5.00%、去皮豆粕7.00%、膨化大豆11.22%、魚粉5.00%、血漿蛋白粉4.00%、乳清粉15.00%、石粉0.50%、碳酸氫鈣0.90%、膽堿0.10%、乳糖8.75%、食鹽0.35%、維生素預混料0.50%、礦物質(zhì)預混料0.50%組成。營養(yǎng)水平：消化能14.48MJ/kg、粗蛋白質(zhì)20.50%、鈣0.85%、總磷0.67%、賴氨酸0.55%、蛋氨酸1.55%、色氨酸0.27%、蘇氨酸1.01%。維生素預混料為每千克飼糧提供：VA12000IU，VD33200IU，VE80IU，VK32.5mg，VE80mg，VB12.5mg，VB26.5mg，VB65mg，VB120.05mg，煙酸45mg，D-泛酸20mg，葉酸1.5mg，生物素0.15mg。礦物質(zhì)預混料為每千克飼糧提供：Fe 150mg，Cu 125mg，Zn 200mg，Mn 30mg，I 0.3mg，Se 0.3mg。營養(yǎng)水平為計算值。

1.2.3 仔豬脾臟T淋巴細胞亞群分類測定 于實驗7、14、21d時，早上喂料前每個重復選1頭仔豬，取脾臟機械破碎制成勻漿，加入適量紅細胞裂解液，靜置后離心去上清，PBS液洗滌后調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。取上述濃度的脾臟淋巴細胞200μL，以小鼠抗豬CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體染色后，流式細胞儀檢測CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細胞百分率，并計算CD3+CD4+T與CD3+CD8+T細胞的比值。

1.2.4 仔豬脾臟淋巴細胞增殖功能測定 于實驗7、14、21d時，早上喂料前每個重復隨機選取1頭仔豬，無菌取脾臟，機械破碎制成勻漿，過200目篩，加入適量紅細胞裂解液，靜置5min，800×g離心10min后去上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，最后以RPMI-1640培養(yǎng)液（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL，小牛血清10%）將細胞稀釋成2.5×106個/mL，制成單細胞懸液（臺盼藍檢測活細胞率大于95%）。取單細胞懸液90μL加入96孔板中，每個樣品重復3孔，并加入50μg/mL的Con A溶液10μL，同時設(shè)陰性對照組（不加Con A）；置37℃，5%CO2箱中培養(yǎng)44h后加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后在Bio-Rad酶聯(lián)免疫檢測儀上測定樣品OD450nm值，以O(shè)D630nm為參比波長，并計算增殖指數(shù)SI（stimulation index，SI），計算公式：SI=實驗孔OD均值/對照孔OD均值。

1.2.5 血清免疫球蛋白含量測定 于實驗7、14、21d時，早上喂料前每個重復欄隨機選取1頭仔豬，前腔靜脈采血1mL，不抗凝分離血清，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，ELISA試劑盒（武漢基因美公司）檢測血清免疫球蛋白IgA，IgG和IgM含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為（平均數(shù)±標準差），并用方差分析（one-way ANOVA）法進行多組間顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣對脾臟T淋巴細胞亞群的變化的影響

T淋巴細胞亞群是機體細胞免疫的重要細胞。CD3+是成熟T淋巴細胞的標志，根據(jù)其表面分子可以分為CD4+和CD8+兩個主要亞群。CD4+為輔助型T淋巴細胞，能結(jié)合外源性抗原，識別MHC-Ⅱ分子；CD8+為細胞毒性T淋巴細胞，能識別內(nèi)源性MHC-Ⅰ分子。T淋巴細胞亞群反映了機體的免疫水平。圖1、圖2為蛹蟲草發(fā)酵五味子藥渣對脾臟T淋巴細胞亞群的影響。

實驗第1周時，陽性對照和實驗組脾臟CD3+百分率和CD4+/CD8+比值均極顯著高于空白對照組（p＜0.01），CD3+CD4+百分率顯著高于空白對照組（p＜0.05）；CD3+CD8+百分率各組間差異不顯著。第2周時，陽性對照和實驗組脾臟CD3+、CD3+CD4+和CD4+/CD8+比值極顯著高于空白對照組（p＜0.01）；陽性對照和實驗組脾臟CD3+CD8+百分率與空白對照組差異不顯著。第3周時，陽性對照和實驗組脾臟CD3+百分率、CD4+/CD8+比值顯著高于空白對照組（p＜0.01）；實驗組CD3+CD4+百分率顯著高于空白組（p＜0.05），但CD3+CD8+百分率顯著低于空白對照組和陽性對照組。結(jié)果表明，蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)和五味子對脾臟T淋巴細胞亞群有正面影響，與劉麗華等[6]發(fā)現(xiàn)五味子水提物可預防小鼠免疫損傷，提高CD3+和CD3+CD4+百分率的報道相一致。

圖2 脾臟CD4+/CD8+值Fig.2 The CD4+/CD8+ratio of splenic T-cell subsets

2.2 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣對仔豬脾臟T淋巴細胞增殖能力的影響

脾臟富含T、B兩種淋巴細胞，淋巴細胞在體內(nèi)外受到抗原或有絲分裂原的刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞并分裂增殖[7]。刀豆蛋白（Con A）誘導的脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化與增殖程度是衡量機體細胞免疫水平的重要指標。蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)和五味子中藥對脾臟T淋巴細胞增殖的影響如圖3所示。

圖3 脾臟T淋巴細胞增殖指數(shù)Fig.3 The stimulation Index（SI）of splenic T-cells

由圖3可知，陽性對照和實驗組1～3周增殖指數(shù)均顯著高于空白對照組（p＜0.01）；且除第1周外，陽性對照和實驗組之間無顯著性差異，均保持在較高穩(wěn)定水平。陽性對照組和實驗組分別在第3周和第2周達最大值；空白對照組增殖指數(shù)與時間呈負相關(guān)性。表明蛹蟲草發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)和五味子中藥組均對仔豬的脾淋巴細胞有直接促進有絲分裂作用，可通過激活T細胞增殖，增強仔豬的細胞免疫功能，這與劉玉芹等[8]以雞為實驗動物研究五味子提高Con A誘導脾淋巴細胞增殖的結(jié)果一致。

2.3 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣對仔豬免疫球蛋白含量變化的的影響

IgG有抗菌、抗病毒作用，且能中和毒素使其失去毒性，調(diào)理、凝聚和沉淀抗原，是初級免疫中最持久、最重要的抗體；IgM是機體初次接觸抗原物質(zhì)最先產(chǎn)生的免疫球蛋白，在機體感染病原后與補體結(jié)合，溶解病原體；IgA除抗菌、抗病毒、抗毒素作用外，還是黏膜免疫防御系統(tǒng)的主要成分[9]。免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量的提高有益于增強動物的免疫功能。

蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)對仔豬免疫球蛋白的影響如圖4所示。第1周時，實驗組IgG含量低于空白對照和陽性對照組（p＜0.05），陽性對照組IgG含量顯著高于空白組（p＜0.05）；實驗組IgM、IgA含量高于空白組（p＞0.05），陽性對照組IgM、IgA含量顯著高于空白組（p＜0.01或p＜0.05）。第2周時，各組IgG含量差異不顯著（p＞0.05）；實驗組IgM含量和空白對照組差異不顯著（p＞0.05），陽性對照組IgM、IgA含量極顯著高于空白對照組（p＜0.01）；實驗組IgA含量高于空白組（p＞0.05）。第3周時，實驗組IgG、IgM含量均高于空白組（p＞0.05）；陽性對照組IgG、IgM含量極顯著高于空白組（p＜0.01）；陽性對照組和實驗組IgA含量顯著高于空白組（p＜0.05或p＜0.01）。這與五味子促進免疫細胞的形成和分化，增加IgG、IgM漿細胞數(shù)量[10]；以及細胞免疫功能增強后細胞因子的分泌增加，調(diào)節(jié)體液免疫有關(guān)。

圖4 血清免疫球蛋白的含量Fig.4 The contents of serum immune globulins

3 結(jié)論與討論

本實驗結(jié)果顯示，五味子藥渣經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵后能提高脾臟CD3+T、CD3+CD4+T比率，上調(diào)CD4+T/ CD8+T細胞比值，促進脾臟T淋巴細胞增殖和增加免疫球蛋白的含量，各檢測指標變化趨勢與五味子一致。在2～3周時，發(fā)酵藥渣CD4+/CD8+比值極顯著（p＜0.01）高于五味子，提示五味子藥渣經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵后具有同等甚至高于五味子的免疫活性。本實驗結(jié)果與張瑞等[11]報道的五味子殘渣對白羽肉鴨免疫功能無影響不一致，表明五味子藥渣經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵后其營養(yǎng)和藥效價值遠大于原五味子藥渣。其原因，一方面由于五味子藥渣中還殘留部分成分，除粗蛋白、粗脂肪、礦物質(zhì)、氨基酸、油脂、糖類、維生素、微量元素、有機酸類等營養(yǎng)物質(zhì)外，還有生物堿、多糖、萜類和揮發(fā)油、香豆素類、木脂素、醌類、黃酮類、甾體及苷類和鞣質(zhì)等。這些殘留成分仍具有部分生物活性，陳榮華等[12]在五味子殘渣中提取到8.46%的粗多糖，并發(fā)現(xiàn)其能增強巨噬細胞吞噬功能，提高血清溶血素水平。另一方面，微生物發(fā)酵具有獨特的生物轉(zhuǎn)化機制[1-3]，蛹蟲草菌利用五味子藥渣中的糖類、蛋白等進行生長，破壞細胞壁使五味子殘留有效成分溶出和富集；在生長中產(chǎn)生初生或次生代謝產(chǎn)物，這些代謝物有可能與五味子藥渣中的成分發(fā)生反應或直接轉(zhuǎn)化形成新的化合物等。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)五味子藥渣經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵后菌質(zhì)中總多糖、五味子酯素和蟲草素含量均高于原五味子藥渣。此外，蛹蟲草菌絲含有氨基酸、脂肪酸、核苷類物質(zhì)、甾醇、甘露醇、多糖、SOD酶等，具有廣泛的免疫活性[13-14]。五味子藥渣發(fā)酵后不僅富含了蛹蟲草菌絲體和五味子殘留原有成分的生物活性，還可能增添了大量未知的免疫活性物質(zhì)。這些免疫活性成分進入機體后促進T淋巴細胞增殖分化，誘導內(nèi)源性細胞因子的產(chǎn)生，激發(fā)機體細胞及體液免疫應答，從而提高機體的免疫功能。

綜上，五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)可作為一種良好的免疫增強劑，提高斷奶應激仔豬免疫抵抗力，在醫(yī)藥和保健品等方面有一定的開發(fā)和應用前景，并有助于解決藥渣浪費和環(huán)境問題。

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Study on immune regulation of Schisandra Chinensis residue fermented by Cordyceps Militaris

LUO Jie，HUANG Chao-xiang，HE Xiao-yu，MOU Chao，RONG Qian，LI Ying-lun*
（Department of Pharmacy，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

To investigate the immune activities of Schisandra Chinensis residue fermented by Cordyceps Militaris. 90 crossbred weaned piglets（Duroc×Landrace×Yorkshire）of 28-day-old were randomly allocated to blank control group（basic diet），positive control group（basic diet plus 0.5%Schisandra Chinensis）and treatment group（basic diet plus 0.2%fermentative fungal substance of Schisandra Chinensis residue）.The experiment lasted 21d.Samples were obtained every week.Splenic T lymphocyte subgroups were measured by flow cytometry（FCM）.The proliferation effect on splenic lymphocyte was observed by CCK-8 method.The serum IgG，IgA and IgM contents were detected by ELISA.Results showed the proportion of CD3+，CD3+CD4+and CD4+/CD8+T-cells in positive control and treatment groups were significantly higher that of blank control group（p＜0.05 or p＜0.01）.Besides，the effect of proliferation activities on splenic T lymphocytes to Con A in positive control and treatment groups was significant difference with blank control group（p＜0.01）.Compared with blank control group，there was a tendency to increase the serum IgA，IgM and IgM in positive control group and treatment group.The study confirmed that Schisandra Chinensis residue fermented by Cordyceps Militaris could improve the cellular and humoral immunologic function of weaned piglets.

Schisandra Chinensis residue；Cordyceps Militaris；fermentation；immunomodulation

TS202.3

A

1002-0306（2014）08-0355-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.073

2013－09－28 *通訊聯(lián)系人

羅杰（1987-），男，在讀碩士研究生，研究方向：中獸藥與中獸醫(yī)。

國家自然科學基金項目（31272599）。