黃參莖葉中酚類提取物的抗氧化活性研究

馬婷婷，田呈瑞，馬錦錦，張 娟，張穎娜，趙 珮，宋溪子

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

黃參莖葉中酚類提取物的抗氧化活性研究

馬婷婷，田呈瑞*，馬錦錦，張 娟，張穎娜，趙 珮，宋溪子

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

為研究黃參莖葉中酚類提取物的抗氧化活性，本文以分光光度法測(cè)定黃參莖葉中酚類提取物的總還原力、亞鐵離子螯合能力、對(duì)β-胡蘿卜素/亞油酸自氧化體系的抑制作用、對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，及對(duì)DPPH自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O2-·）的清除作用，并與人工合成的抗氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和天然抗氧化劑VC進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：黃參莖葉多酚具有較好的體外抗氧化性能，部分指標(biāo)甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照；相同濃度下黃參莖葉多酚粗提物和純化物在不同測(cè)定體系中的清除能力有顯著性差異（p＜0.05）。黃參莖葉中酚類提取物可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)和利用。

黃參，莖葉，酚類提取物，抗氧化活性

大量研究表明，活性氧自由基與機(jī)體的衰老、腫瘤、心血管和炎癥疾病等有密切關(guān)系，一些外源性天然抗氧化劑能拮抗體內(nèi)過量的自由基，從而預(yù)防相關(guān)疾病的產(chǎn)生，維護(hù)人體的健康[1]。因此，尋找合適有效的外源抗氧化劑尤其是天然抗氧化劑便成了科技工作者研究的興趣所在[2]。植物多酚則是一類來(lái)源豐富的天然抗氧化劑。

黃參（Sphallerocarpus gracilis），系傘形科迷果芹屬植物迷果芹，多年生草本，根塊狀或圓錐形，通體金黃色，可食[1]，是一種極具開發(fā)前景的藥食兼用植物，整個(gè)植株均可入藥或食用，是一種傳統(tǒng)的藏藥，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛[3]。根據(jù)《本草綱目》和《晶珠本草》記載，黃參有補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋陰壯陽(yáng)、通經(jīng)活絡(luò)、舒肝健胃的功效，并且對(duì)黃水病，腰腎寒癥有很好的療效，被譽(yù)為“小人參”。黃參在我國(guó)分布廣、資源豐富，然而，目前有關(guān)黃參的研究、開發(fā)較少，僅有的文獻(xiàn)報(bào)道也只局限于黃參根部、籽中的化學(xué)成分、微量元素的分析及功效作用[4-7]。而有關(guān)黃參莖葉抗氧化方面的研究國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道，本研究以黃參莖葉為原料，采用7種體外抗氧化體系全面評(píng)價(jià)黃參莖葉多酚的抗氧化活性，以期為黃參莖葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃參莖葉 于2012年7月采自甘肅山丹軍馬場(chǎng)，采第二年莖葉；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鈉、福林酚試劑，無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、氯仿、鐵氰化鉀、二氯化亞鐵、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、鄰苯三酚、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、菲洛嗪、β-胡蘿卜素、亞油酸、吐溫40、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水等 均為分析純，西安化學(xué)試劑廠；BHT、抗壞血酸 食品級(jí)，西安化學(xué)試劑廠。

BS200S-WEl電子分析天平 北京賽多利斯；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪；LXJ-II B型高速離心機(jī) 上海安亭；SG4050C恒溫水浴鍋；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 上海安亭；722型可見分光光度計(jì) 上海光譜；FW100型高速萬(wàn)能植物粉碎機(jī)；其他均為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備與儀器。

1.2 樣品制備工藝流程

黃參莖葉→去除雜物→洗凈→曬至半干→烘箱內(nèi)40℃烘干→植物粉碎機(jī)粉碎→過60目篩→70%乙醇70℃超聲提取30min→濾液真空30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干→真空冷凍干燥→多酚粗提物→經(jīng)X-5大孔樹脂純化（上樣流速2mL/min，上樣濃度1mg/mL，上樣溫度30℃，70%乙醇解析）→多酚純化物。

分別將黃參莖葉多酚粗提物和純化物的凍干樣品用70%的乙醇配成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液即為待測(cè)液；用相同濃度的抗壞血酸和BHT溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 樣品總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定。取0.2mL提取液于10mL容量瓶中，加入1.0mL的福林酚試劑，再加入7.5%的碳酸鈉2mL，用蒸餾水定容至10mL搖勻，暗室放置60min后在765nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度（A），以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)x、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝0.1159x＋0.0045，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999。將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得試樣中總多酚的濃度。

1.4 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照Brandwilliams等[8]的方法，稍作修改以測(cè)定黃參莖葉多酚粗提物和純化物對(duì)DPPH自由基的清除能力。實(shí)驗(yàn)測(cè)定前，配制0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液。精確吸取2.0mL的不同濃度多酚樣品溶液（0.1～ 1.0mg/mL）和6.0mL新配制的DPPH溶液于試管中混勻，避光反應(yīng)30min于517nm處測(cè)定其吸光度?？瞻讓?duì)照用等體積的蒸餾水代替多酚樣品液測(cè)定乙醇溶液中未反應(yīng)之前DPPH的吸光度。用與樣品溶液同濃度的抗壞血酸溶液和BHT溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。以樣品液濃度為橫坐標(biāo)，自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖分析樣品清除自由基的能力。對(duì)DPPH自由基的清除能力按式（1）計(jì)算：

其中：I表示對(duì)自由基的清除率，%；Ai表示樣品溶液和DPPH溶液混合液的吸光度（2mL樣品溶液+ 6mL的DPPH溶液）；Aj表示未加DPPH溶液的樣品溶液的吸光度（2mL樣品溶液+6mL的乙醇溶液）；A0表示未加樣品時(shí)DPPH溶液的吸光度（2mL乙醇溶液+ 6mL的DPPH溶液）。

1.5 β-胡蘿卜素/亞油酸體系中抗氧化能力的測(cè)定在Siddhuraju等[9]的方法的基礎(chǔ)上稍作修改：將5mg的β胡蘿卜素溶于10mL氯仿中，再加入0.125mL的亞油酸和2mL的Tween-20，將此混合物移入圓底瓶中于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4min之后加入500mL蒸餾水。向各試管中加入2mL不同濃度的待測(cè)液和8mL反應(yīng)液，置于50℃水浴中每隔25min測(cè)其在470nm處的吸光度（分別在不同濃度待測(cè)液構(gòu)成的體系中，以蒸餾水作為空白調(diào)零），共測(cè)量150min?？寡趸芰Π聪铝惺剑?）計(jì)算：

其中：S為樣品的抗氧化能力，%；A0表示樣品溶液在零反應(yīng)時(shí)刻的吸光值；A0’表示空白對(duì)照溶液在零反應(yīng)時(shí)刻的吸光值；At表示樣品溶液在t反應(yīng)時(shí)刻對(duì)應(yīng)的吸光值；At’表示空白對(duì)照t反應(yīng)時(shí)刻對(duì)應(yīng)的吸光值。

1.6 還原能力的測(cè)定

黃參莖葉多酚樣品液還原能力的測(cè)定在Vaquero等[10]的方法基礎(chǔ)上稍作修改：取2.5mL的樣液加入裝有2.5mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=6.6）的試管中，再加入2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液混合均勻。50℃反應(yīng)20min后，加入2.5mL 10%的三氯乙酸在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液5mL與4mL的蒸餾水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵溶液混合。反應(yīng)10min后，在700nm處測(cè)其吸光度?；旌弦旱奈舛仍礁弑硎军S參莖葉多酚樣品提取液的還原能力越強(qiáng)。

1.7 清除羥基自由基能力的測(cè)定

按照Yan等[11]的方法測(cè)定黃參莖葉多酚樣品提取液對(duì)羥基自由基的清除能力。將2mL的樣品溶液與2mL氯化亞鐵（2mmol/L）、2mL的過氧化氫溶液（2mmol/L）和2mL的水楊酸（6mmol/L）混合，再加入10mL蒸餾水，在37℃的水浴鍋中反應(yīng)30min，在510nm處設(shè)置空白對(duì)照測(cè)其吸光值。陽(yáng)性對(duì)照為抗壞血酸和BHT。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖分析對(duì)羥基自由基的清除能力。清除率（SA）按以下式（3）計(jì)算：

其中：A0表示未加樣品混合液的吸光度（2mL的氯化亞鐵+2mL過氧化氫+2mL水楊酸）；Ai表示樣品的吸光度（2mL的氯化亞鐵+2mL過氧化氫+2mL水楊酸+2mL的樣品溶液）；Aj未加過氧化氫溶液樣品的吸光度（2mL的氯化亞鐵+2mL水楊酸+2mL的樣品溶液）；SA為樣品對(duì)羥基自由基的清除率，%。

1.8 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定

根據(jù)稍作修改的Marklund等[12]的方法測(cè)定樣液清除超氧陰離子的能力。取4.5mL Tris-HCL（0.05mol/L，pH=8.2）的緩沖液，25℃水浴預(yù)熱20min，然后加入1mL不同濃度的樣品溶液和0.4mL鄰苯三酚溶液（0.025mol/L）混合均勻。將混合液置于25℃水浴反應(yīng)4min。加入1.0mL鹽酸溶液（8mmol/L）終止反應(yīng)。設(shè)置空白對(duì)照于320nm處測(cè)定混合液的吸光值。以抗壞血酸和BHT作陽(yáng)性對(duì)照。樣品液清除超氧陰離子的能力按以下式（4）計(jì)算：以蒸餾水作參比，420nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

其中：I表示清除率，%；A0表示未加樣品混合液的吸光值；Ai表示測(cè)試樣品的吸光值；Aj表示不含鄰苯三酚混合液的吸光值。

1.9 對(duì)亞硝酸鹽清除作用的測(cè)定[13]

取不同濃度的樣品液2mL于25mL容量瓶，加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液（5μg/mL）3mL，加入檸檬酸-磷酸緩沖溶液（pH＝3.0）5mL，37℃下反應(yīng)30min，立即加入2mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后，加入1mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15min，以5mL提取液為參比調(diào)零，在544 nm處測(cè)吸光度。按式（5）計(jì)算NO2－的清除率。

M（%）=（A0-A）/A0×100 式（5）

其中：M表示清除率，%；A0表示未加樣品時(shí)亞硝酸鹽的吸光值；A表示加樣品時(shí)亞硝酸鹽的吸光值。

1.10 亞鐵離子鰲合能力 移取1mL不同濃度的樣品液，加入1mL 0.1mmol/L硫酸亞鐵和1mL 0.25mmol/L菲洛嗪。反應(yīng)混合物靜置10min，在562nm下測(cè)定吸光度[14]。用1mL 70%的乙醇代替提取物作為對(duì)照，亞鐵離子鰲合能力用式（6）計(jì)算：

D（%）=（A0-A）/A0×100 式（6）

其中：D表示亞鐵離子螯合率，%；A0表示未加樣品液時(shí)的吸光值；A表示加樣品液時(shí)的吸光值。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 采用EXCEL2007、SPSS等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃參莖葉多酚提取物中總酚含量

經(jīng)Folin-Ciocalteu法測(cè)定，黃參莖葉多酚粗提物中總多酚含量為8.29%，純化物中總多酚含量為32.62%。

2.2 清除DPPH自由基的能力

不同質(zhì)量濃度的樣品和陽(yáng)性對(duì)照清除DPPH自由基能力如圖1所示。黃參莖葉多酚粗品、純品、BHT清除DPPH自由基的能力在低濃度范圍內(nèi)量效關(guān)系增加明顯，但在高濃度范圍內(nèi)清除能力增加較為平緩，而VC在整個(gè)濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出超強(qiáng)的抗氧化性；顯著性分析顯示純品對(duì)DPPH自由基的清除力高于同濃度下的粗品和BHT，在1mg/mL時(shí)其清除率高達(dá)92.32%，但略低于VC（95.86%）；粗品在（0.1～0.6mg/mL）濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除能力高于BHT，而在（0.6～ 1.0mg/mL）濃度范圍內(nèi)低于BHT；綜上比較可知，黃參莖葉中多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖1 樣品、BHT和VC對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effects of sample，BHT and VCon DPPH radical

圖2 樣品、BHT和VC在β-胡蘿卜素/亞油酸體系中的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activity of sample，BHT，and VCby β-carotene-linoleate model system

圖3 樣品、BHT和VC對(duì)β-胡蘿卜素漂白的抑制效果Fig.3 Bleaching inhibitory effect of sample，BHT，and VCon the β-carotene

2.3 β-胡蘿卜素/亞油酸體系中的抗氧化能力

圖2顯示了抗氧化劑存在的情況下，與β-胡蘿卜素/亞油酸體系耦合氧化過程中，β-胡蘿卜素吸光值逐漸降低的過程。從圖2可看出，與VC相比，各濃度樣品、BHT均具有顯著的抗氧化作用。多酚樣品在亞油酸體系中具有較高的過氧化抑制能力，這與文獻(xiàn)[15]中的研究報(bào)道相一致。VC作為一種親水性抗氧化劑，在水包油乳化體系中，效果不明顯。相反的，親脂性抗氧化劑（酚酸、黃烷酮、黃烷醇等）在上述水包油體系中具有較強(qiáng)的抗氧化性能。按照式（2）計(jì)算150min時(shí)不同質(zhì)量濃度的黃參莖葉多酚樣品、BHT和抗壞血酸在β-胡蘿卜素/亞油酸體系中的抗氧化能力，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，質(zhì)量濃度為0.9mg/mL的VC溶液在此體系中的抗氧化能力很小，僅為12.16%，而質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的BHT溶液在此體系中具有顯著的抗氧化效果，其抑制效果為87.64%。黃參莖葉多酚提取物在此體系中也具有較顯著的抗氧化能力，當(dāng)其粗品質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，清除率為61.78%，當(dāng)其濃度增加到0.9mg/mL時(shí)，其清除率增加到76.64%。純品質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，清除率為67.37%，當(dāng)其濃度增加到0.9mg/mL時(shí)，其清除率增加到84.56%。此外還可得出，在此體系中，各濃度的多酚純品的抗氧化性均高于粗品。

2.4 樣品的還原能力

黃參莖葉多酚、抗壞血酸和BHT的還原能力如圖4所示。從圖4中可得出，隨各組質(zhì)量濃度的增加，其還原力也隨之增加。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，還原力與濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，同等濃度條件下，還原能力的大小順序?yàn)閂C＞BHT＞純品＞粗品。此外，顯著性分析顯示相同濃度下黃參莖葉多酚粗品和純品的還原力差異較小，且兩者的還原能力均較低。說明黃參莖葉多酚具有較弱的還原能力。

圖4 樣品、BHT和VC的還原能力Fig.4 Reducing power of sample，BHT and VC

2.5 清除羥基自由基的測(cè)定

從圖5可發(fā)現(xiàn)，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，黃參莖葉多酚粗提物、純化物、BHT清除羥基自由基的能力隨樣品濃度增大而逐漸增強(qiáng)，VC對(duì)羥基自由基的清除能力明顯大于其他三者，在0.4mg/mL時(shí)其清除率便高達(dá)98.45%；同時(shí)還可看出：黃參莖葉多酚粗品、純品、BHT對(duì)羥基自由基的清除能力無(wú)顯著性差異（p＞0.05），在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，三者對(duì)羥基自由基的清除率基本保持在21.25%～49.46%，說明黃參莖葉酚類提取物具有一定的清除羥基自由基的能力，且其清除能力與BHT相當(dāng)。

圖5 樣品、BHT和VC對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effects of sample，BHT and VCon hydroxyl radical

2.6 清除超氧陰離子的能力

圖6所示為黃參莖葉多酚提取物、抗壞血酸和BHT對(duì)超氧陰離子的清除效果。從圖中可知，VC對(duì)超氧陰離子具有較高的清除能力，在1mg/mL時(shí)其清除率高達(dá)86.18%，且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系；粗品、純品、BHT對(duì)超氧陰離子基本沒有清除能力，某些濃度點(diǎn)甚至出現(xiàn)負(fù)清除的現(xiàn)象，說明實(shí)驗(yàn)樣品濃度較低時(shí)不但不能有效清除超氧陰離子自由基，反而能促進(jìn)其生成，可能原因是由于被測(cè)物質(zhì)體系中含有與產(chǎn)生超氧陰離子自由基物質(zhì)—鄰苯三酚相似的物質(zhì)，從而促進(jìn)了超氧陰離子自由基的產(chǎn)生，具體原因及機(jī)理有待于進(jìn)一步研究[16]。

圖6 樣品、BHT和VC對(duì)超氧陰離子的清除效果Fig.6 Scavenging effects of sample，BHT and VCon superoxide free radical

2.7 對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

圖7所示為黃參莖葉多酚提取物、抗壞血酸和BHT對(duì)亞硝酸鹽的清除效果。從圖7中可以看出，黃參莖葉多酚提取物對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除效果，并隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除率也隨之升高，具有明顯的量效關(guān)系，并且同濃度下清除亞硝酸鹽的大小順序?yàn)閂C＞BHT＞純品＞粗品。同時(shí)還可得出：黃參莖葉多酚粗品、純品對(duì)亞硝酸鹽的清除能力無(wú)顯著性差異（p＞0.05），在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除率在7.39%～46.18%之間。

圖7 樣品、BHT和VC對(duì)亞硝酸鹽的清除效果Fig.7 Scavenging effects of sample，BHT and VCon nitrite

2.8 樣品的亞鐵離子螯合能力

測(cè)定亞鐵離子螯合能力的大小也是評(píng)價(jià)氧化劑抗氧化性能常用的方法。螯合能力越強(qiáng)表示被評(píng)價(jià)的抗氧化劑潛在的抗氧化性就愈強(qiáng)[17]。從圖8可知，黃參莖葉多酚粗品的亞鐵離子螯合能力顯然高于同濃度下純品、BHT和VC。VC在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)顯示很弱的亞鐵離子螯合能力（5%以下），而BHT和純品在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)為無(wú)亞鐵離子螯合能力，粗品和純品對(duì)亞鐵離子螯合能力的不同可能是由于不同純度的酚類提取物中酚類化合物組成不同所致。

圖8 樣品、BHT和VC的亞鐵離子螯合能力Fig.8 Ferrous ion chelating ability of sample，BHT and VC

3 結(jié)論

本文分別采用7種體外抗氧化體系，對(duì)黃參莖葉多酚粗提物、純化物的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：黃參莖葉多酚具有較高的清除DPPH自由基的能力、脂質(zhì)抗氧化能力；較好的清除羥基自由基、亞硝酸鹽的能力；一定的還原能力；基本不具有清除超氧陰離子的作用，但具有較弱的亞鐵離子螯合能力。綜上所述，黃參莖葉多酚提取物顯示具有較好的抗氧化性能，部分指標(biāo)甚至比陽(yáng)性對(duì)照效果還好，可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用。

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Antioxidant capacity of phenolic extracts from Sphallerocarpus gracilis stem leaves

MA Ting-ting，TIAN Cheng-rui*，MA Jin-jin，ZHANG Juan，ZHANG Ying-na，ZHAO Pei，SONG Xi-zi
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

The antioxidant activity of phenolic extracts from Sphallerocarpus gracilis stem leaves was studied. The antioxidant activity of the extract was evaluated by spectrophotometry on its ability of scavenging 1-diphenyl-2-picrylhydrazy（DPPH·），hydroxyl radical（·OH），superoxide anion radical（O2-·），nitrite，β-carotene bleaching test，and total reducing power.BHT and VCwere used as positive control.Results indicated that the polyphenol extracts had a good antioxidant capacity，some indicators even better than the positive control.In addition，polyphenol extracts and purified in a different measurement system in the scavenging ability were quite different at the same concentration（p＜0.05）.It could be used as natural antioxidants further developed and utilized.

Sphallerocarpus gracilis；stem leaves；phenolic extracts；antioxidant

TS201.2

A

1002-0306（2014）08-0109-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.015

2013－08－02 *通訊聯(lián)系人

馬婷婷（1987-），女，博士研究生，研究方向：食品新資源開發(fā)利用。

陜西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基金（2013CXS005）。