面包蝦中副溶血性弧菌溫度預(yù)測模型的建立

賀 群，黃 和，*，劉 亞，蔣志紅，勵(lì)建榮

（1.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.渤海大學(xué)，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013）

面包蝦中副溶血性弧菌溫度預(yù)測模型的建立

賀 群1，黃 和1，*，劉 亞1，蔣志紅1，勵(lì)建榮2

（1.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.渤海大學(xué)，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013）

為探討面包蝦生產(chǎn)過程中副溶血性弧菌的生長規(guī)律，測定了不同溫度（10、14、18、22、26、30、37℃）下副溶血性弧菌的生長曲線，運(yùn)用Origin8.0軟件和DMFit軟件，分別采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型對(duì)生長曲線進(jìn)行擬合，建立初級(jí)模型。應(yīng)用平方根模型對(duì)由最適生長模型得出的最大比生長速率進(jìn)行擬合，建立二級(jí)生長預(yù)測模型。研究結(jié)果表明，通過模型檢驗(yàn)比較，修正Gompertz模型模型對(duì)7種溫度培養(yǎng)條件下的擬合度較好（決定系數(shù)=0.9917），進(jìn)一步擬合所得二級(jí)模型擬合度較好（決定系數(shù)=0.9687），得到了最適生長方程，可用于10～37℃溫度條件下的面包蝦中副溶血性弧菌生長預(yù)測。

面包蝦，副溶血性弧菌，生長模型

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于世界各地溫暖的海洋環(huán)境中，人類感染的主要臨床癥狀是胃腸炎。自1998年以來，國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒超過沙門氏菌躍居首位[1]。國內(nèi)外對(duì)副溶血性弧菌預(yù)測模型的研究主要集中在初級(jí)和二級(jí)模型，盧曉鳳[2]、田金玲等[3]研究了蛤肉、模擬蟹肉中副溶血性弧菌不同溫度條件下的生長規(guī)律，Gompertz方程擬合度較高。Zwietering等[4]比較了Gompertz和其他方程后，認(rèn)為只有修正Gompertz方程更能充分描述細(xì)菌生長曲線。姬華等[5]采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型對(duì)肉湯和對(duì)蝦中副溶血性弧菌的生長曲線進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)擬合度都較高。Miles等[6]建立了不同培養(yǎng)條件下肉湯中副溶血性弧菌生長速率的平方根模型，Soon等[7]在Miles等的研究基礎(chǔ)上，建立了肉湯和牡蠣勻漿中副溶血性弧菌的生長動(dòng)力學(xué)模型，修正Gompertz方程和平方根模型擬合度都較高。

副溶血性弧菌的感染主要是由于生食或誤食未煮熟或加工過程中再污染的海產(chǎn)品，尤其是蝦[8]。對(duì)蝦作為我國水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的拳頭產(chǎn)品[9]，在2005年初美國對(duì)我國初級(jí)冷凍蝦類產(chǎn)品開始征收高額反傾銷稅后，出口嚴(yán)重受阻，面包蝦作為一種鮮蝦的深加工產(chǎn)品，帶動(dòng)了我國整個(gè)蝦類產(chǎn)品的出口。面包蝦在生產(chǎn)過程中除去低溫幾乎沒有任何的抑菌工序，因此，通過探討副溶血性弧菌在面包蝦表面的生長規(guī)律，特別是探討其在面包蝦中不同溫度培養(yǎng)條件下的生長模型的構(gòu)建，對(duì)開展副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和完善面包蝦加工技術(shù)具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌（ATCC17802） 廣東省微生物研究所，菌株在含3%NaCl和20%甘油的腦心浸液肉湯（BHI）中于-80℃保存，菌株接種于2.5%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20h，活化3代備用；腦心浸液肉湯（BHI）、TCBS瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（2.5%NaCl TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂（NA） 均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；NaCl分析純 廣東省光華科技股份有限公司。

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；拍擊式均質(zhì)器 西班牙IUL公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（5～50℃，±1.5℃） 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LTI-700型低溫恒溫培養(yǎng)箱（-20～70℃） 上海愛朗儀器有限公司；電子天平 日本島津公司；1mL、200μL移液槍 德國Eppendorf公司；BCD-277冰箱 博西華家用電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將副溶血性弧菌劃線接種于TCBS平板，挑取典型綠色斗笠狀菌落，接種至含有9mL 2.5%NaCl TSB的試管中，37℃、120r/min培養(yǎng)12h，利用無菌的2.5%NaCl TSB培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)菌液OD600為0.5[5]，用無菌3%NaCl堿性蛋白胨水梯度稀釋，選擇10-4稀釋度作為添加的菌懸液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)用無菌面包蝦的制備[5，10]將面包蝦分裝于高壓平口袋中，約40g/包，真空包裝，面包蝦在400MPa、28℃下處理20min。超高壓處理后準(zhǔn)確稱取10g面包蝦于無菌均質(zhì)袋中，加入90mL無菌3%氯化鈉堿性蛋白胨水，均質(zhì)機(jī)拍打90s，吸取100μL面包蝦勻漿液，采用傾注平板法倒3%NaCl NA和2.5%NaCl TSA平板，37℃培養(yǎng)48h，不長菌代表超高壓處理殺死了所有的雜菌。將無菌的面包蝦置于-18℃冰箱中備用。

1.2.3 副溶血性弧菌的接種、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)[5]無菌稱取10g無菌面包蝦置于直徑為90mm無菌培養(yǎng)皿中，每份蝦仁用無菌槍頭均勻接種菌懸液100μL，接種后使面包蝦的初始菌數(shù)達(dá)到101～103cfu/g。

接種完畢后，分別置于10、14、18、22、26、30、37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)溫度，在選定的時(shí)間取出樣品采用平板計(jì)數(shù)法測菌數(shù)。

1.2.4 生長模型的建立 一級(jí)模型的擬合采用Origin 8.0軟件和DMFit軟件（http：//modelling.combase.cc/ DMFit.aspx），分別用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型擬合面包蝦在不同溫度下實(shí)際測得的副溶血性弧菌濃度隨時(shí)間變化的生長曲線，再做對(duì)比，選出最適模型，三種模型的方程分別為：

式（1）、式（2）中，logNt是在時(shí)間t時(shí)菌落計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值[log（cfu/mL）]；A即初始菌量的對(duì)數(shù)值logN0[log（cfu/mL）]；C是初始菌量和最大菌量之間的差值[log（cfu/mL）]；M是生長速率達(dá)到最大值時(shí)的時(shí)間（h）；B是在時(shí)間M時(shí)的相對(duì)最大生長速率（h-1）。

式（3）中，y0和ymax分別是細(xì)菌的初始菌量和最大菌量；μm是最大比生長速率（h-1）；tlag是遲滯期。

修正Gompertz模型、修正Logistic模型生長參數(shù)參照姬華等[4]的μm、tlag來計(jì)算。

將μm作為溫度的函數(shù)建立模型，采用Ratkowsky等描述的平方根模型[13]，模型方程為：

式（4）中，μm是最大比生長速率，a是回歸系數(shù)，Tmin是細(xì)菌出現(xiàn)生長的理論最低溫度。根據(jù)初級(jí)最適模型求得μm，將μm和對(duì)應(yīng)的溫度代入方程式，擬合出b和Tmin，然后代入原方程，求得二級(jí)模型。二級(jí)模型采用Origin 8.0軟件擬合。

1.2.5 模型的檢驗(yàn) 一級(jí)模型的擬合優(yōu)度采用決定系數(shù)R2評(píng)價(jià)。二級(jí)模型采用殘差平方和（RSS）、平方根誤差（RMSE）、偏差因子（Bf）和準(zhǔn)確性因子（Af）來評(píng)定[12]，表達(dá)式如下：

式中，μobs和μpred分別最大比生長速率的觀測值和預(yù)測值，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 對(duì)不同時(shí)間菌落計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值與初始菌數(shù)對(duì)數(shù)值的差值lg（Nt/N0），采用Origin 8.0軟件擬合修正Gompertz方程和修正Logistic方程，用DMFit軟件擬合方程，通過比較決定系數(shù)R2確定最適模型。

表1 修正Gompertz模型、修正Logistic模型參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz model and modified Logistic model

表2 Baranyi模型參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌一級(jí)生長模型的建立

修正Gompertz模型、修正Logistic模型對(duì)副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生長曲線進(jìn)行擬合，由Origin 8.0軟件計(jì)算出擬合方程的各個(gè)參數(shù)，如表1所示。

使用Baranyi模型對(duì)副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生長曲線進(jìn)行擬合，DMFit軟件同時(shí)還計(jì)算出了模型的兩個(gè)變量生長速率μm和遲滯期tlag以及擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)差s和決定系數(shù)R2，所得的參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析如表2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型擬合，均能得到較高的決定系數(shù)，決定系數(shù)均值分別為0.9917、0.9882、0.9867，選用修正Gompertz模型得出的參數(shù)進(jìn)一步建立二級(jí)模型，以lg（Nt/N0）對(duì)時(shí)間t作圖，副溶血性弧菌的一級(jí)模型擬合曲線如圖1所示。由圖1可以看出，隨著溫度的升高，微生物的最大比生長速率也隨之升高。

2.2 副溶血性弧菌二級(jí)生長模型的建立

將不同溫度下修正Gompertz模型擬合得到的最大比生長速率μm代入Ratkowsky方程擬合，即得到最

從圖2中可以看出，10～37℃溫度范圍內(nèi)，副溶血性弧菌的比生長速率的平方根與溫度呈線性關(guān)系，并隨著溫度的升高而增加，擬合方程的決定系數(shù)R2達(dá)到了0.9687。

比生長速率的預(yù)測值與實(shí)測值的殘差平方和（RSS）、平方根誤差（RMSE）、偏差因子（Bf）、準(zhǔn)確性因子（Af）見表3。大生長速率-溫度的二級(jí)模型，擬合曲線見圖2。

表3 比生長速率的預(yù)測值與實(shí)測值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 3 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，二級(jí)模型具有較高的R2和較低的RSS值，表明Ratkowsky平方根模型對(duì)生長速率的擬合度較好，通過數(shù)學(xué)參數(shù)檢驗(yàn)，比較μm的預(yù)測值與實(shí)測值，可以計(jì)算出偏差因子和準(zhǔn)確因子，從上表可以看出，RMSE值較小，預(yù)測值和實(shí)測值的偏差很小，偏差因子Bf接近于1；準(zhǔn)確因子Af也接近于1，表明模型的擬合效果好，準(zhǔn)確度高，能很好地預(yù)測面包蝦中副溶血性弧菌的生長。

圖1 在10、14、18、22、26、30、37℃條件下面包蝦中副溶血性弧菌的一級(jí)生長模型Fig.1 The primary growth model for Vibrio parahaemolyticus in Bread Shrimp at 10，14，18，22，26，30 and 37℃

圖2 最大生長速率和溫度二級(jí)模型擬合曲線圖Fig.2 Fitted curve of groeth rate and temperature of the secondary model

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)研究了10～37℃下面包蝦中副溶血性弧菌的生長規(guī)律，建立了副溶血性弧菌生長的初級(jí)模型和二級(jí)模型，修正Gompertz模型較好的擬合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這與對(duì)蝦、牡蠣勻漿中副溶血性弧菌生長曲線的擬合結(jié)果相似，由此進(jìn)一步擬合的平方根模型，擬合度較高，通過數(shù)學(xué)參數(shù)檢驗(yàn)得出，RMSE值較低，偏差因子和準(zhǔn)確因子均接近于1，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)建立的模型的可靠性。企業(yè)在流通、加工過程中，可以通過此模型對(duì)整個(gè)生產(chǎn)流程和銷售過程的時(shí)間進(jìn)行有效的控制，從而達(dá)到更好地控制副溶血性弧菌生長的效果，并可作為面包蝦質(zhì)量安全的有效保證，為面包蝦的出口起到保障作用，最終增強(qiáng)在國內(nèi)外市場上的競爭力。

影響副溶血性弧菌生長的因素有溫度、pH、鹽度、水分活度等因素，溫度是主要的影響因素之一。本實(shí)驗(yàn)著重研究了不同溫度條件下面包蝦中副溶血性弧菌生長規(guī)律，建立了可靠的預(yù)測模型來描述溫度對(duì)副溶血性弧菌生長速率的影響，對(duì)面包蝦的生產(chǎn)銷售環(huán)節(jié)有一定的理論指導(dǎo)意義。今后將就低溫儲(chǔ)藏、鹽度、pH等對(duì)面包蝦中的副溶血性弧菌生長的影響做進(jìn)一步的研究，以期能通過多種模型的比較選擇來建立完整的面包蝦中副溶血性弧菌的預(yù)測模型。

[1]劉秀梅．食源性疾病監(jiān)控技術(shù)的研究[J]．中國食品衛(wèi)生雜志，2004，16（1）：3-9．

[2]盧曉鳳，張培正，李遠(yuǎn)釗，等．2%NaCl TSB及單凍煮蛤肉中副溶血性弧菌生長模型的建立及應(yīng)用[J]．中國食物與營養(yǎng)，2006（9）：24-27．

[3]田金玲．模擬蟹肉中副溶血性弧菌生長預(yù)測模型的建立及應(yīng)用[D]．湛江：廣東海洋大學(xué)，2010．

[4]Zwietering M H，Jongenburger L，Rombouts F M，et al. Modeling of the bacterial growth curve[J].Appl Environ Microbiol，1990，56（6）：1875-1881.

[5]姬華．對(duì)蝦中食源性弧菌預(yù)測模型建立及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[D]．無錫：江南大學(xué)，2012．

[6]Miles D W，Ross T，Olley J，et al.Development and evaluation of a predictive model for the effect of temperature and water activity on the growth rate of Vibrio parahaemolyticus[J].Int J Food Microbiol，1997，16，38（2-3）：133-142．

[7]Soon K S，Min K J，Jung Y J，et al.A model of the effect of temperature on the growth of pathogenic and nonpathogenic Vibrio parahaemolyticus isolated from oysters in Korea[J].Food Microbiol，2008，25（5）：635-641．邵懿，薛長湖，董平，等．超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用[J]．漁業(yè)現(xiàn)代化，2007，34（4）：58-60．

[8]Alam M J，Miyoshi S I，Shinoda S.Studies on pathogenic Vibro parahaemolyticus during a warm weather season in the Seto Inland Sea，Japan[J].Environmental Microbiology，2003，5（8）：706-710．[9]艾紅，黃巧珠，徐澤智，等．我國對(duì)蝦產(chǎn)品貿(mào)易結(jié)構(gòu)與出口競爭力分析[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（11）：127-131．

[10]殷允旭．蝦仁的超高壓殺菌工藝研究[D]．安徽：合肥工業(yè)大學(xué)，2007．

[11]Baranyi J，Roberts T A.Mathematics of predictive food microbiology[J].Int J Food Microbiol，1995，26（2）：199-218.

[12]Ross T.Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[J].J Appl Bacteriol，1996，81（5）：501-508.

[13]Ratkowsky D A，Olley J，McMeekin T A，et al.Relationship between temperature and growth rate of bacteria cultures[J].J Bacteriol，1982，149（1）：1-5.

Establishment of growth predictive model of Vibrio parahaemolyticus in bread shrimp

HE Qun1，HUANG He1，*，LIU Ya1，JIANG Zhi-hong1，LI Jian-rong2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Food Safety Key laboratory of Liaoning Province，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

To study the growth law of V.parahaemolyticus in the process of bread shimp，growth curves under different temperatures（10，14，18，22，26，30，37℃，respectively）were determined.The modified Gompertz，modified Logistic and Baranyi models，respectively，were applied to fit the growth curves by Origin 8.0 software and DMFit software，and the primary model was established.The root-squaring model were used to fit the maximum specific growth rates obtained by the optimum growth model for the establishment of the secongary model.Results showed that the modified Gompertz model was more accurate and useful in fitting V.parahaemolyticus growth curves than the modified Logistic and Baranyi&Robert models，respectively（R2= 0.9917）.And the secondary model had a high goodness-of-fit（R2=0.9687）.The optimum growth equations were obtained.The modified Gompertz model coulde be used for predicting the growth of V.parahaemolyticus in Bread Shrimp under above temperature condition.

bread shrimp；Vibrio parahaemolyticus；growth model

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.010

2013－08－19 *通訊聯(lián)系人

賀群（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B06）；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2011B090400154）；湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（湛科[2010]174號(hào)）。