中藥野艾揮發(fā)物抗菌活性與化學成分分離鑒定研究

鄭 濤 程再功 朱 鈞

1.泰州職業(yè)技術學院，江蘇泰州225300；2.揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰州225321；3.江蘇萊芙時代生物科技有限公司，江蘇泰州225309

中藥野艾揮發(fā)物抗菌活性與化學成分分離鑒定研究

鄭 濤1程再功2朱 鈞3

1.泰州職業(yè)技術學院，江蘇泰州225300；2.揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇泰州225321；3.江蘇萊芙時代生物科技有限公司，江蘇泰州225309

目的對中藥野艾的藥用價值進行研究，主要對其揮發(fā)物進行抑菌活性研究及化學成分進行分離鑒定，進而為野艾的藥用價值尋找依據(jù)。方法①采用超臨界二氧化碳（CO2）萃取法提取野艾的揮發(fā)油，然后測定揮發(fā)油對于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的殺菌抑制作用；②使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對揮發(fā)油進行化學成分分離鑒定。結果①揮發(fā)油對革蘭陽性菌殺菌效果較好，對真菌的效果一般，對3種革蘭陰性菌無殺菌活性；②分離鑒定出39種成分，野艾揮發(fā)油主要成分是蒿酮（15.47%）、蒿醇（9.55%）、順式丁香烯（8.85%）、艾醇（7.28%）和桉葉素（6.78%）等。結論揮發(fā)油對所測試的菌落有很好抑制作用，對革蘭陽性菌有很好的殺菌作用。

野艾；揮發(fā)油；化學成分；抗菌活性

野艾屬于菊科蒿屬草本植物，俗名苦艾、野艾蒿等，是我國的傳統(tǒng)中藥。艾草性味苦、辛、溫，入脾、肝、腎?！侗静菥V目》記載：艾以葉入藥，性溫、味苦、無毒、純陽之性、通十二經(jīng)、具回陽、理氣血、逐濕寒、止血安胎等功效，亦常用于針灸。故又被稱為“醫(yī)草”，現(xiàn)在臺灣正流行的“藥草浴”，大多就是選用艾草。關于艾葉的性能，《本草》載：“艾葉能灸百病。”《本草從新》說：“艾葉苦辛，生溫，熟熱，純陽之性，能回垂絕之陽，通十二經(jīng)，走三陰，理氣血，逐寒濕，暖子宮，……以之灸火，能透諸經(jīng)而除百病。”說明用艾葉作施灸材料，有通經(jīng)活絡、祛除陰寒、消腫散結、回陽救逆等作用?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)，艾葉揮發(fā)油含量多，1，8-桉葉素（占50%以上），其他有α-側柏酮、倍半萜烯醇及其酯。風干葉含礦物質10.13%，脂肪2.59%，蛋白質25.85%，以及維生素A、B1、B2、C等。灸用艾葉，一般以越陳越好，故有“七年之病，求三年之艾”（《孟子》）的說法。全草有調經(jīng)止血﹑安胎止崩﹑散寒除濕之效。治月經(jīng)不調﹑經(jīng)痛腹痛﹑流產(chǎn)﹑子宮出血，根治風濕性關節(jié)炎﹑頭風﹑月內(nèi)風等。因它可削冰令圓，又可炙百病，為醫(yī)家最常用之藥?，F(xiàn)代實驗研究證明，艾葉具有抗菌及抗病毒作用；平喘、鎮(zhèn)咳及祛痰作用；止血及抗凝血作用；鎮(zhèn)靜及抗過敏作用；護肝利膽作用等。艾草可作“艾葉茶”、“艾葉湯”、“艾葉粥”等食譜，以增強人體對疾病的抵抗能力。艾草具有一種特殊的香味，這特殊的香味具有驅蚊蟲的功效，所以，古人常在門前掛艾草，一來用于避邪，二來用于趕走蚊蟲，因此，對于野艾成分的研究尤其必要。本研究對野艾的揮發(fā)油進行提取分離、成分鑒定，并研究其對微生物的殺滅抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料野艾購于深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，產(chǎn)地廣東，超臨界萃取裝置、氣相色譜-質譜聯(lián)用儀等均為國內(nèi)研發(fā)制作。試驗所用蒸餾水均采用自動雙重純水蒸餾器制作。菌株均來自武漢大學的菌種保藏中心，實驗采用牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基（酵母浸膏1 g，牛肉浸膏4 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH＝7.0，121℃滅菌30 min）培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油提取

采用超臨界CO2萃取法進行揮發(fā)油提取[1-2]：①將收集的野艾地上部分洗凈陰干切碎，稱重為8.9 kg，裝入萃取裝置；②萃取裝置溫度設置為35℃，通入CO2，排出裝置中的空氣；③打開壓縮機，調節(jié)儀器內(nèi)部壓強保持在16 MPa，調節(jié)CO2出口閥，保存20 kg/h；持續(xù)80 min，打開分離器，取出萃取物；④關閉萃取裝置，放空CO2，取出揮發(fā)油粗制提取物，然后放入2倍的無水乙醇，攪拌均勻，靜止24 h；⑤真空抽濾，再除去蠟質沉淀物，最后將濾液在30°回收乙醇，得到精制野艾揮發(fā)油。

1.2.2 抑菌圈測定

試驗對野艾揮發(fā)油的抑菌效果測定使用的是濾紙片瓊脂平板擴散法[3]。首先，在三個固體平板均勻涂上牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)液；其次，取已滅菌的濾紙片（7 mm）粘取約15 μL已稀釋好的揮發(fā)油樣品置于平板上，每個菌種取6個平行組；最后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌組溫度為36℃，24 h，真菌組溫度為27℃，48 h，測算菌落直徑3次求取平均值，并以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.3 最低殺菌濃度（MIC）和最低抑菌濃度（MBC）的測定

采用稀釋法對MCI和MBC進行測定[4]。在96孔的平板上涂上液體培養(yǎng)基、接種菌落、再加入已稀釋好的各濃度揮發(fā)油樣品。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌組溫度為36℃，24 h，真菌組溫度為27℃，48 h，后觀察，每個菌種的每個揮發(fā)油樣品相同稀釋度的實驗各三組，重復兩次。MIC的確定標準[5]：肉眼無法觀察到培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)物渾濁的樣品為最低抑菌濃度。MBC的確定標準：首先是取出培養(yǎng)后無渾濁的平板再培養(yǎng)，以再培養(yǎng)后平板無菌落生成為最低樣品的抑制濃度。并以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.4 使用質譜聯(lián)用儀對野艾揮發(fā)油進行化學成分分離鑒定

首先，將揮發(fā)油樣品以1∶5的比例溶于乙酸乙酯，搖勻，分流進樣。鑒定分以下兩個部分：

1.2.4.1 色譜條件色譜柱（25 m×0.25 mm），柱溫：前兩分鐘保持45℃，再以5℃每分鐘的速度提高至100℃，保持2 min，再以10℃每分鐘提高到220℃，進樣量：0.5 μL，流速：1 mL/min，載氣：He，分流比：30。采用歸一化法計算其相對的百分比含量。

1.2.4.2 質譜條件進物口溫度220℃，EL電離方式，電離電壓為70 EV，離子源溫度為330℃，掃描范圍為35～350 amu，各組成成分分子式通過NIST進行檢索。1.3統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 野艾揮發(fā)油結果和化學成分GC-MS分析

經(jīng)氣相色譜分離出揮發(fā)油中的39種成分，再經(jīng)質譜圖NIST檢索確認，再用面積歸一化法，分析出其各自的相對含量，其余成分因各種原因未能確認。表1結果顯示，野艾揮發(fā)油主要的五種成分分別是蒿酮（15.52%）、蒿醇（9.63%）、順式丁香烯（8.71%）、艾醇（7.37%）和桉葉素（6.47%）等。

表1 野艾揮發(fā)油GC-MS分析結果和化學成分

2.2 野艾揮發(fā)油對三類菌的抗菌效果

對革蘭陽性菌的抗菌效果相對較好，對真菌的效果一般，對革蘭陰性菌無效。具體見表2。

3 討論

試驗對野艾揮發(fā)油的化學成分研究采用了氣-質聯(lián)用的分析方法，首先通過使用超臨界CO2萃取法對野艾揮發(fā)油進行分類提純鑒定[6]，其次再使用氣相色譜對揮發(fā)油進行成分分離鑒定，查出揮發(fā)油中所含有的各化學成分組成，再利用歸一法測算揮發(fā)油中各化學成分的相對百分含量，最后再通過質譜聯(lián)用儀進行確定，采用NIST計算機分子庫進行自動檢索，確定揮發(fā)油中的各種化學成分及其含量[7]。

表2 野艾揮發(fā)油對各種微生物的抗菌活性

試驗中對于野艾的殺菌抑菌研究也表明野艾揮發(fā)油對測試菌種有較強的抑制和殺滅作用，尤其是對革蘭陽性菌的殺菌活性很強[8]。在過往的研究中也曾有過類似的報道[9-11]，蒿酮、蒿醇和桉葉素對革蘭陽性菌有很強的的殺滅作用，對部分真菌和革蘭陰性菌也有抑制作用，在這種也可以看出這三種物質是野艾抗菌的物質基礎，野艾揮發(fā)油對幾種細菌的生長抑制作用會隨著揮發(fā)油濃度的提高而加強[12-15]。

本文對揮發(fā)油抗菌活性的研究還利用了揮發(fā)油中芳香類化合物包括檸檬烯、蒎烯等的抗菌作用，尤其是萜類的化合物。有數(shù)據(jù)顯示[4]，芳香族化合物（例如檸檬烯）的特點是：其一，具有較強的香氣；其二，具有較好的抗菌效果；其三，具有較高的藥物成分；其四，具有較大的生物活性。因此可將其作為制作生態(tài)抗病毒殺菌劑的合理材料。

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Activity and chemical separation appraisal research of traditional Chinese medicine mugwort volatiles antibacterial

ZHENG Tao1CHENG Zaigong2ZHU Jun3
1.Taizhou Polytechnic College,Jiangsu Province,Taizhou225300,China;2.Yangtze River Pharmaceutical Group Co., Ltd.,Jiangsu Province,Taizhou225321,China;3.Jiangsu Laifu Era Biotechnology Co.,Ltd.,Jiangsu Province,Taizhou 225309,China

Objective To study medicinal value of TCM mugwort,mainly refer to the volatiles study of antibacterial activity and chemical composition of isolation,identification and basis for mugwort medicinal value.Methods①Supercritical fluid extraction method was used to extract the volatile oil of mugwort,and determination of volatile oil in gram-positive bacteria and gram-negative bacteria and fungi bactericidal inhibitory effect;②gas chromatographymass spectrometry instrument was used to identify chemical separation of the volatile oil.Results①The essential oil of gram positive bacteria sterilization effect was good,but to the fungus,the effect was general,and had no bactericidal activity for the three kinds of gram-negative bacteria;②39 species composition were separated and identified,mugwort naphtha were mostly artemisia alcohol of 15.47%,artemisia ketone of 9.55%,cis clove ene of 8.85%,ai alcohol of 7.28%and eucalyptus evvh of 6.78%,etc..Conclusion The essential oil has a good inhibitory effect on the colony test, and has a good bactericidal effect on gram-positive bacteria.

Wild wormwood;Volatile oil;Chemical composition;Antimicrobial activity

R284.2

A

1673-7210（2014）01（a）-0097-03

2013-08-22本文編輯：衛(wèi)軻）

江蘇省國際科技合作計劃項目（編號BZ2010039）。

鄭濤（1981.10-），男，碩士研究生；研究方向：天然藥物化學。