去脂軟肝方對高脂誘導(dǎo)大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實(shí)驗(yàn)研究

卞 瑤 黃文俊 姚 政 石安華 施欽柔 殷 華 陳文慧

云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500

去脂軟肝方對高脂誘導(dǎo)大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的實(shí)驗(yàn)研究

卞 瑤 黃文俊 姚 政 石安華 施欽柔 殷 華 陳文慧

云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500

目的探討去脂軟肝方對高脂誘導(dǎo)脂肪肝大鼠肝組織血管性血友病因子的影響作用。方法高脂飲食復(fù)制大鼠脂肪肝模型，將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為三組：正常組，模型組，去脂軟肝方組。去脂軟肝方組予去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g）共12周；HE染色觀察肝臟脂肪變性情況；測定大鼠血清血脂、肝脂、血漿血小板聚集率及肝組織血管性血友病因子（vWF）。結(jié)果12周末模型組大鼠血脂[血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；去脂軟肝方組血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)水平比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組大鼠肝臟組織中vWF比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織vWF比模型組低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論去脂軟肝方能明顯改善高脂誘導(dǎo)脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性。減少vWF分泌、抑制血小板聚集、減輕血管及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是其作用機(jī)制之一。

去脂軟肝方；高脂；脂肪肝；大鼠；血管性血友病因子

近年來，隨著社會(huì)的發(fā)展，生活水平提高，我國患脂肪肝人群數(shù)量逐年遞增，部分脂肪肝如果遷延不愈，可進(jìn)展為肝纖維化甚至肝硬化[1]。因此，如何在早期阻止脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展是目前研究的關(guān)鍵。課題組前期對云南省榮譽(yù)名中醫(yī)、著名中西醫(yī)結(jié)合肝病專家蘇漣教授以“辨病為主，從瘀而治”思路擬定的“去脂軟肝方”進(jìn)行研究，證實(shí)該方具有較好的改善高脂誘導(dǎo)脂肪肝血脂、肝脂肝及肝組織脂肪變性作用[2-6]。但其作用機(jī)制及關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚不完全清楚。本研究采用高脂誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠，觀察脂肪肝大鼠模型與血瘀證、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）關(guān)系，探討去脂軟肝方治療脂肪肝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠30只，體重（100±10）g，清潔級(jí)。購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK（川）2010-16，云南中醫(yī)學(xué)院（以下簡稱“我院”）動(dòng)物房飼養(yǎng)，造模及觀察。

1.2 藥品及主要試劑

去脂軟肝方三七1 g、山楂15 g、菊花10 g、白術(shù)15 g、青皮6 g、莪術(shù)15 g等七味中藥）購自我院門診部藥房，由我院中藥制劑室制成流浸膏（含生藥1.44 g/mL）；膽固醇（Cholesterol）分析純，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬油，購自昆明沃爾瑪超市，生產(chǎn)日期：20110326；大鼠vWF ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司），批號(hào)20110401A：購自昆明晨綠生物科技開發(fā)有限公司。

1.3 造模方法

將大鼠分為正常組10只，高脂飲食造模組20只，正常組大鼠每天予以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠每天予以高脂飼料（88%普通飼料基礎(chǔ)上加10%豬油，2%膽固醇）喂養(yǎng)，連續(xù)12周，均自由飲水。

1.4 分組及給藥

自造模之日起，高脂飲食造模組20只，隨機(jī)分為模型組10只和去脂軟肝方組10只；正常組和模型組給予生理鹽水灌胃（1 mL/200 g，每日），去脂軟肝方組按去脂軟肝方藥液灌胃（1 mL/200 g，每日），連續(xù)12周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織HE染色

HE染色顯示正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，胞圓形，呈條索狀排列，可見中央靜脈。模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見超過2/3的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細(xì)胞核擠向胞膜下，可見肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明（胞漿疏松化），嚴(yán)重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變）；去脂軟肝方組可見一定量的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡。

2.2 去脂軟肝方對高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)變化的影響

模型組大鼠血脂（血清TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠肝組織勻漿（肝臟TC、TG）與比正常組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；去脂軟肝方組血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)比模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 去脂軟肝方對脂肪肝大鼠血清脂質(zhì)和肝組織脂質(zhì)變化的影響（mmol/L，x±s）

2.3 去脂軟肝方對高脂飼料致脂肪肝模型大鼠血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子的影響

模型組大鼠血小板聚集率比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組大鼠肝臟組織中血管性血友病因子比正常組高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；去脂軟肝方組血漿血小板聚集率變化及肝組織血管性血友病因子比模型組低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 去脂軟肝方對脂肪肝大鼠血小板聚集率及肝組織血管性血友病因子的影響（x±s）

3 討論

本研究采用改良高脂飼料即88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇復(fù)制大鼠脂肪肝模型，12周末HE染色顯示模型組大鼠肝細(xì)胞明顯腫大，呈黃色，切面油膩，中央靜脈周圍脂肪病變明顯，體積較正常明顯增加，可見超過2/3的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡，有的空泡融合將細(xì)胞核擠向胞膜下，可見肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松呈網(wǎng)狀、半透明（胞漿疏松化），嚴(yán)重者胞漿幾乎完全透明（氣球樣變），同時(shí)，大鼠血清與肝組織勻漿檢測TC、TG均有不同程度的增高，出現(xiàn)典型脂肪肝大鼠模型。

目前脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究表明脂肪肝患者大多存在高血脂及微循環(huán)障礙的改變[6]，一方面血脂升高、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇能夠促進(jìn)血小板高聚集率，發(fā)生血小板活化[7-8]；另一方面血小板活化，進(jìn)一步引起血液高凝狀態(tài)的出現(xiàn)，血液黏度增高，血液循環(huán)阻力升高，加重微循環(huán)障礙，從而加重血管內(nèi)皮損傷、肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致脂肪肝病變發(fā)展。

vWF是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的重要標(biāo)志物，通過測定vWF的水平可以判定患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷的慢性或急性階段[9]。vWF是介導(dǎo)血小板與血管內(nèi)皮下組織黏附的主要分子，目前已知它能參與血小板-血管壁，血小板-血小板之間的相互作用，在血小板活化、血液凝固中發(fā)揮重要作用[10]，有研究表明，vWF在肝臟損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮積極作用，肝組織中vWF可沿肝竇的表達(dá)使肝竇內(nèi)血流處于血栓前狀態(tài)，易于形成微血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，肝臟微循環(huán)障礙可以影響相應(yīng)供血區(qū)域肝細(xì)胞的營養(yǎng)狀況，造成肝細(xì)胞缺血缺氧[11]。有學(xué)者也認(rèn)為vWF升高與肝臟血管內(nèi)皮損害程度成正比，可以作為反映肝臟血管內(nèi)皮損害的一個(gè)非特異性指標(biāo)[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，12周末模型大鼠血清與肝組織勻漿檢測TC、TG均有不同程度的增高的同時(shí)，血漿血小板聚集率升高，肝組織vWF分泌增多，且與正常組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明肝組織vWF因子分泌增多，血小板聚集率增加，發(fā)生血小板活化，加重微循環(huán)障礙，從而影響到肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）。表明脂肪肝模型大鼠與vWF、血小板聚集率、血小板活化及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間有一定關(guān)聯(lián)。

云南著名中西醫(yī)結(jié)合肝病專家蘇漣教授對早期脂肪肝提出“肝郁脾虛，虛瘀交結(jié)”病理特點(diǎn)，并從多年臨床用藥經(jīng)驗(yàn)中，反復(fù)篩選組成以三七、莪術(shù)、赤芍等活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”方藥治療脂肪肝取得明顯的臨床療效。從脂質(zhì)代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行多項(xiàng)藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其對高脂飼料所致的高血脂、肝脂有降低作用，同時(shí)還能明顯降低停飼高脂飼料后大鼠的肝脂、血脂水平，表明其不僅能抑制脂質(zhì)的吸收，還能促進(jìn)脂質(zhì)的降解。本研究與以往研究結(jié)果相一致[2-6]。因此脂肪肝的中醫(yī)治療從瘀而治，有臨床及藥理研究的支持，血小板活化是血瘀證產(chǎn)生的重要病理生理基礎(chǔ)，運(yùn)用活血化瘀為主方藥可以抑制血小板聚集，減少血小板活化，從而改善肝臟微循環(huán)障礙，減輕脂肪肝病變發(fā)展。本研究結(jié)果表明以活血化瘀為主的“去脂脂軟肝方”可能是通過減少vWF分泌抑制血小板聚集，減少血小板活化，減輕血管及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑來實(shí)現(xiàn)的。

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Experimental research of Quzhi Ruan'gan Prescription in effect of von Willebrand factor in rats with fatty liver caused by high fat

BIAN YaoHUANG WenjunYAO ZhengSHI AnhuaSHI QinrouYIN HuaCHEN Wenhui
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming650500,China

Objective To investigate the impact of Quzhi Ruan'gan Prescription in von Willebrand factor(vWF)of rats with fatty liver caused by high fat.Methods The model of rats with fatty liver was made by high fat diet,and the model rats were randomized to 3 groups:normal group,model group and Quzhi Ruan'gan Prescription group.Quzhi Ruan'gan Prescription group was treated with gavage of Quzhi Ruan'gan Prescription(1 mL/200 g)for 12 weeks.The condition of fatty degeneration of liver was observed with HE staining.The serum lipid,liver lipid,the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue were tested.Results At the end of 12th weekend,the levels of serum lipid(TC,TG)in model group were higher than those in normal group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the levels of serum lipid and liver lipid in Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group(P＜0.05); the rate of serum platelet aggregation in the model group was higher than that of normal group,the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the vWF in liver tissue in the model group was higher than that of normal group, the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue of Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group,the differences were highly statistically significant(P＜0.01).Conclusion Quzhi Ruan'gan Prescription can improve the conditions of high fat resulting in serum lipid,liver lipid and liver fatty degeneration of rats with fatty liver obviously.One of the mechanism may be associated with reduction of the secretion of vWF,inhibition of platelet aggregation,lightening the damage of blood vessel and liver sinusoidal endothelial cell.

Quzhi Ruan'gan Prescription;High fat;Fatty liver;Rats;Von Willebrand factor

R575.2

A

1673-7210（2014）01（a）-0004-03

2013-09-03本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81160492）。

卞瑤（1964.7-），女，江蘇句容人，副教授，云南中醫(yī)學(xué)院繼職學(xué)院院長，長期從事生物化學(xué)的理論及實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)研究。

陳文慧（1963.10-），女，廣東興寧人，教授，云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副院長，長期從事溫病學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)的教學(xué)及科研工作。