中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性評價的方法學(xué)探討

阮浩瀾 陳琪 黎旸 孫清萍 陳素珍

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室，廣東廣州510180

中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性評價的方法學(xué)探討

阮浩瀾 陳琪 黎旸 孫清萍 陳素珍

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室，廣東廣州510180

目的研究柴胡注射液和丹參注射液在犬腎近端小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）和人胚腎細(xì)胞（HEK-293細(xì)胞）模型的毒性作用，并探討中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性檢測的實(shí)驗(yàn)方法。方法選用馬兜鈴酸A作為陽性對照，將不同廠家和批次的丹參注射液、柴胡注射液的原液及稀釋液，與MDCK細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞共同孵育，通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）量化細(xì)胞毒性，計(jì)算相對增殖率，進(jìn)行中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性評價。結(jié)果在MDCK細(xì)胞模型中，兩批丹參注射4個液稀釋濃度下毒性分級顯示為0級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級；在HEK-293細(xì)胞模型中，一批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為1級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批稀釋27、81倍后顯示為1級；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級。結(jié)論利用腎臟細(xì)胞來源的細(xì)胞，可嘗試建立中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性檢測的實(shí)驗(yàn)方法。

中藥注射液；腎；細(xì)胞毒性；四甲基偶氮唑鹽比色法

中藥所致的腎臟損害在世界范圍內(nèi)日益受到重視，目前顯示許多中藥具有腎毒性作用[1]，中藥腎毒性已經(jīng)嚴(yán)重制約了中藥在臨床上的使用。中藥注射液大部分都是經(jīng)血管給藥，其對腎臟損害的風(fēng)險性更應(yīng)提高警惕，如穿心蓮內(nèi)酯注射液已發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致患者急性腎損害[2]。因此，建立一個快捷有效的中藥注射液腎毒性評價方法具有重要的意義。

目前體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于生物材料、醫(yī)療器械和藥品包裝材料的毒性研究[3-5]，可以對受試物潛在的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測。在中藥注射液方面，有研究選用小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）進(jìn)行體外細(xì)胞毒性的分析[6-7]，但用腎臟來源的細(xì)胞進(jìn)行中藥注射液的腎毒性體外評價的研究少見報道。本研究選用來源于腎臟的犬腎近端小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）和人胚腎細(xì)胞（HEK-293細(xì)胞），參考中藥注射液在L929細(xì)胞毒性檢測的四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）[6]，考察中藥注射液對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性作用，對建立基于MDCK細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞的中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性模型進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柴胡注射液（廣東羅浮山國藥股份有限公司，批號L13C302），丹參注射液（廣東遠(yuǎn)大藥業(yè)有限公司，批號130501、130502、130503）。馬兜鈴酸A（中國藥品生物制品檢定所，批號110746-200406）。馬兜鈴酸A用二甲基亞砜（DMSO，終濃度為0.5%）溶解，配成100 μmol/mL儲存液。實(shí)驗(yàn)時，用DMEM培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器

電子天平（Sartorius，德國）；Eppendorf離心機(jī)。生物安全柜（Nuaire，美國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫。取對數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）以105個/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL。置37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT法檢測馬兜鈴酸A對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的抑制作用用DMEM培養(yǎng)液將馬兜鈴酸A分別配制成0.5、5、50、500 nmol/L四種不同的濃度（各自DMSO終濃度為0.5%）。96孔板內(nèi)細(xì)胞分為對照組、馬兜鈴酸A四種不同濃度組，每組6孔。對照組更換含0.5%DMSO的DMEM培養(yǎng)液；馬兜鈴酸A各濃度組更換為含0.5、5、50、500 nmol/L馬兜鈴酸A的DMEM培養(yǎng)液。每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT檢測。

1.3.3 中藥注射液稀釋及培養(yǎng)將中藥注射液用DMEM培養(yǎng)液按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81進(jìn)行稀釋，空白對照為DMEM培養(yǎng)液。將上述樣品液及對照液分別加入接種MDCK細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用MTT法進(jìn)行檢測并計(jì)算細(xì)胞相對增殖率并對細(xì)胞毒性進(jìn)行評價。

1.3.4 MTT法檢測中藥注射液對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的細(xì)胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）及細(xì)胞毒性評價RGR的計(jì)算公式：RGR（%）=(試驗(yàn)組平均OD值)/(對照組平均OD值)× 100%；細(xì)胞毒性評價標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T14233.2-2005細(xì)胞毒性試驗(yàn)[8]。依據(jù)RGR對毒性反應(yīng)分級，其中0級：RGR≥100%，為無毒性；1級：80%≤RGR＜100%，為極輕度毒性；2級：50%≤RGR＜80%，為輕微毒性；3級：30%≤RGR＜50%，為中度毒性；4級：0%≤RGR＜30%，為重度毒性。

1.3.5 MTT檢測方法參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢測[9]，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，混勻，用酶標(biāo)儀測定光密度值（OD值），測定波長為490 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，各組方差齊用LSD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，若方差不齊，用Tamhane's T2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 馬兜鈴酸A對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的抑制作用

當(dāng)MDCK細(xì)胞給予0.5、5、50、500 nmol/L的馬兜鈴酸A孵育24 h后，OD值均出現(xiàn)下降。與對照組比較，50、500 nmol/L組的OD值明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HEK-293細(xì)胞給予0.5、5、50、500 nmol/L的馬兜鈴酸A孵育24 h后，50、500 nmol/L組的OD值也明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明馬兜鈴酸A對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞增殖均具有明顯的抑制作用。見表1。

表1 MTT法檢測馬兜鈴酸A對MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞增殖的影響

2.2 中藥注射液對MDCK細(xì)胞相對增殖率的影響

3個批次的丹參注射液和1個批次的柴胡注射液對MDCK相對增殖率的影響見表2。由表可見，2個批次（批號130501和130503）的丹參注射液4個稀釋濃度的細(xì)胞毒性分級均為0級。1個批次（批號130502）稀釋9、27、81倍后細(xì)胞毒性分級均為0級。柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級。

2.3 中藥注射液對HEK-293細(xì)胞相對增殖率的影響

3個批次的丹參注射液和1個批次的柴胡注射液與HEK-293孵育24后，毒性分級結(jié)果顯示，同一批丹參注射液（批號130502）4個稀釋濃度的細(xì)胞毒性分級均為1級，同一批（批號130501）稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批（批號130503）稀釋27、81倍后顯示為1級。柴胡注射液稀釋27倍后顯示為27、81級。見表3。

表2 不同中藥注射液對MDCK細(xì)胞相對增殖率的影響

表3 不同中藥注射液對HEK-293細(xì)胞相對增殖率的影響

3 討論

馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ是馬兜鈴酸的兩個主要成分[10]，其中馬兜鈴酸Ⅰ（又名馬兜鈴酸A）是馬兜鈴酸的主要毒性成分[11]，具有明顯的腎毒性作用[12]。有研究顯示馬兜鈴酸在體外可明顯抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E細(xì)胞）增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，MDCK細(xì)胞也是一種腎小管上皮細(xì)胞，常用于中藥成分的體外腎毒性評價研究[14-15]，故本實(shí)驗(yàn)選用MDCK細(xì)胞作為中藥注射液體外腎毒性評價的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，馬兜磷酸A均能夠顯著抑制MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的增長，可選用為該細(xì)胞模型的陽性對照藥。為了探討體外腎細(xì)胞毒性模型對不同批次和不同品種的中藥注射液的毒性反應(yīng)，本研究選用了三批丹參注射液和一批柴胡注射液進(jìn)行考察，參考GB/T14233.2-2005細(xì)胞毒性試驗(yàn)對中藥注射液體外腎細(xì)胞的毒性反應(yīng)進(jìn)行分級。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MDCK細(xì)胞模型中，兩批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為0級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級；在HEK-293細(xì)胞模型中，一批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為1級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批稀釋27、81倍后顯示為1級；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級。中藥注射液諸多因素均可引起細(xì)胞毒性，如主要的中藥成分、pH值、滲透壓、藥品輔料等均可以引起細(xì)胞死亡。因此，本實(shí)驗(yàn)不同批次和不同品種的中藥注射液之間毒性反應(yīng)分級可能存在較大的差異。若建立起穩(wěn)定的體外細(xì)胞毒性模型，對同一品種的中藥注射液進(jìn)行多批次的毒性檢測并進(jìn)行毒性分級，綜合分析數(shù)據(jù)后或許可對中藥注射液的腎毒性安全性評價提供有意義的參考數(shù)據(jù)。

在本實(shí)驗(yàn)中，不同種屬來源的MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞對同一批次的中藥注射液的毒性顯示出不同的靈敏度，因此，建立中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性模型還可以選用多種來源的腎細(xì)胞，如人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）等[16]，進(jìn)行對比分析，或許最終能從諸多腎臟來源的細(xì)胞中建立起一個穩(wěn)定可靠的中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性模型對中藥注射液的腎毒性進(jìn)行安全性評價。

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Methodological evaluation of the renal cell toxicity of Chinese medicine injection

RUAN HaolanCHEN QiLI YangSUN QingpingCHEN Suzhen
Department of Pharmacology and Toxicology,Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangdong Province, Guangzhou510180,China

Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods.Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug.MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection.Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate(RGR)was calculated. Results In MDCK cell model,the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9,27,81 times.The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27,81 times.Meanwhile,in HEK-293 cell model,the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels.One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9,27,81 times.One was shown as Class 1 after diluting 27,81 times.The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27,81 times.Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

Chinese medicine injection;Kidney;Cell toxicity;MTT assay

R285.1

A

1673-7210（2014）09（a）-0011-04

2014-05-19本文編輯：衛(wèi)軻）

廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省立項(xiàng)資助科研課題（編號20111153）。

阮浩瀾（1979-），男，廣東茂名人，博士；研究方向：藥品安全性與有效性評價。

陳琪，碩士，副主任藥師，從事藥品安全性與有效性評價工作。