酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床應(yīng)用價(jià)值

董 璇 李天興 韓曉群 黃漢平

1.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核性腦膜炎科，湖北武漢430012；2.武漢市醫(yī)療救治中心胸外科，湖北武漢430012；3.武漢市醫(yī)療救治中心感染科，湖北武漢430012；4.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核呼吸科，湖北武漢430012

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床應(yīng)用價(jià)值

董 璇1李天興2韓曉群3黃漢平4

1.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核性腦膜炎科，湖北武漢430012；2.武漢市醫(yī)療救治中心胸外科，湖北武漢430012；3.武漢市醫(yī)療救治中心感染科，湖北武漢430012；4.武漢市醫(yī)療救治中心結(jié)核呼吸科，湖北武漢430012

目的探討酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選擇2011年8月～2012年8月武漢市醫(yī)療救治中心住院21例結(jié)核性胸膜炎患者（結(jié)核組）和18例肺癌胸膜轉(zhuǎn)移患者（惡性腫瘤組），利用ELISPOT法檢測(cè)兩組患者胸水對(duì)結(jié)核特異性抗原刺激產(chǎn)生反應(yīng)，分泌γ干擾素的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性率。結(jié)果ELISPOT結(jié)果顯示結(jié)核組胸水中T淋巴細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率為85.7%（18/21），明顯高于惡性腫瘤組[16.7%（3/18）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISPOT的敏感性與特異性分別為85.7%、83.3%。結(jié)論ELISPOT靈敏性和特異性較高，對(duì)于結(jié)核性胸膜炎具有一定的臨床診斷價(jià)值。

結(jié)核性胸膜炎；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)；診斷

結(jié)核性胸膜炎是我國(guó)較為常見(jiàn)的一種疾病，它的發(fā)病率與結(jié)核病的疫情有密切關(guān)系[1]。因此它的及時(shí)診斷與治療十分重要。但在臨床工作中，由于目前診斷方法仍舊以胸水細(xì)胞學(xué)檢查，胸水細(xì)菌學(xué)檢查為主，常與其他性質(zhì)的胸腔積液疾病如惡性胸腔積液難以區(qū)分[2-3]。隨著對(duì)結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的深入研究，以IFN-γ為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫診斷成為研究熱點(diǎn).該診斷方法的理論基礎(chǔ)是當(dāng)結(jié)核菌致敏的T細(xì)胞再次遭遇人分枝桿菌抗原時(shí)可在體內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ。體外IFN-γ釋放反應(yīng)是用人結(jié)核分枝桿菌特異或非特異抗原體外刺激受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞，使少量T淋巴細(xì)胞充分接受刺激[4-5]，從而分泌大量IFN-γ，然后用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）檢測(cè)IFN-γ濃度或計(jì)數(shù)分泌的細(xì)胞的方法。本研究通過(guò)采用ELISPOT方法對(duì)臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液及臨床診斷為惡性胸水患者的胸腔積液進(jìn)行產(chǎn)生γ干擾素的T細(xì)胞的檢測(cè)，來(lái)探討該方法在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2011年8月～2012年8月武漢市醫(yī)療救治中心（以下簡(jiǎn)稱“我中心”）收治的21例結(jié)核性胸膜炎患者作為結(jié)核組，其中男13例，女8例，年齡為20～70歲，平均（40.0±5.5）歲。所有患者均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：①有胸痛，胸悶，發(fā)熱典型癥狀；②胸腔積液常規(guī)生化等檢查提示為滲出液，結(jié)核抗體陽(yáng)性，細(xì)胞學(xué)檢查以淋巴細(xì)胞為主；③胸水涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；④胸膜活檢病理組織學(xué)檢查提示肉芽腫或干酪病變；⑤初治抗結(jié)核方案治療后癥狀好轉(zhuǎn)，胸水吸收較明顯。將我中心同期收治的18例肺癌胸膜轉(zhuǎn)移患者作為惡性腫瘤組，男10例，女8例，年齡40～78歲，平均（59.0±4.5）歲。所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、胸液檢查、影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診，兩組性別、年齡一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我中心倫理委員會(huì)通過(guò)，患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胸水中單個(gè)核細(xì)胞的提取及凍存用無(wú)菌方法采集100 mL胸水，室溫，1800 r/min（r=5 cm），15 min離心得沉淀物。用等體積的無(wú)菌PBS或生理鹽水重懸，混勻。用移液管加至裝有等體積的淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）的15 mL離心管內(nèi)，室溫2300 r/min（r=5 cm），30 min離心，用移液管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層至50 mL離心管，用40 mL的PBS或生理鹽水洗滌，室溫，1500 r/min（r=5 cm），10 min離心得沉淀。所有患者于采集標(biāo)本前均未給予免疫抑制治療。

1.2.2 ELISPOT檢測(cè)按照結(jié)核桿菌感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)診斷試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)，每孔加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫靜置5～10 min，傾倒。加入細(xì)胞懸液：按照實(shí)驗(yàn)安排，結(jié)核性胸膜炎及惡性胸水每個(gè)測(cè)試樣本需4孔，加入不同樣本細(xì)胞，100μL/well。陰性對(duì)照：每孔加入10μL無(wú)血清培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照：每孔加入10μL PHA，測(cè)試孔A：每孔加入10μL結(jié)核桿菌特異混合多肽A。測(cè)試孔B：每孔加入10μL結(jié)核桿菌特異混合多肽B。孵育：當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h后，裂解細(xì)胞：傾倒孔內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基。加冰冷的去離子水，200μL/well，4℃冰箱放置10 min低滲裂解細(xì)胞。洗板后加入檢測(cè)抗體孵育：每孔加入100μL稀釋好的生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育1 h。親和素孵育：加入100μL稀釋好的酶標(biāo)親和素，37℃孵育1 h，洗板5次后，每孔加入100μL的顯色液，室溫避光靜置15～45 min（20～25℃，顯色25 min較合適）。將孔內(nèi)的液體倒出，打開(kāi)板底座，用不含離子的蒸餾水對(duì)正反面及底座部分反復(fù)洗滌3～5遍，終止后觀察顯色。將板置于在室內(nèi)的陰涼處，避光，等待自然干燥后將底座關(guān)閉。采用ELISPOT板斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，記錄并分析ELISPOT斑點(diǎn)的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 結(jié)果判斷

當(dāng)測(cè)試孔A和（或）測(cè)試孔B達(dá)到下列標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：①如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，用測(cè)試A和（或）測(cè)試孔B的斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)；②如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，測(cè)試孔A和（或）測(cè)試孔B的斑點(diǎn)數(shù)必須≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。ELISPOT的敏感性=（陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)）%，特異性=[1-（陰性/陽(yáng)性）]%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者胸水中T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果的比較

結(jié)核組中ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性率為85.7%（18/21），明顯高于惡性腫瘤組[16.7%（3/18）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者胸水中T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果的比較[n（%）]

2.2 結(jié)核組ELISPOT的敏感性與特異性

結(jié)核組ELISPOT法結(jié)測(cè)的敏性性為85.7%，特異性為83.8%。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核組中T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性率為85.7%，明顯高于惡性腫瘤組（16.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISPT檢驗(yàn)反應(yīng)陽(yáng)性的T細(xì)胞的特異性為85.7%，敏感性為83.3%，可作為結(jié)核性胸膜炎的一種新的診斷方法。

近年來(lái)有研究認(rèn)為，結(jié)核性胸膜炎發(fā)病機(jī)制如下[6-7]：當(dāng)機(jī)體遭受結(jié)核桿菌侵襲后會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，并分泌特異性抗原，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，如招募CD4+T淋巴細(xì)胞，并使之聚集于胸膜腔內(nèi)，分泌各種細(xì)胞因子，作用于效應(yīng)細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞），并使之活化，通過(guò)吞噬作用將病原微生物局限在局部區(qū)域后吞噬消滅，同時(shí)胸膜的毛細(xì)血管網(wǎng)進(jìn)一步充血，并發(fā)生滲出現(xiàn)象及伴隨后來(lái)的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。而再次過(guò)程中，IFN-γ是起著關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，IFN-γ的重要功能之一便是活化巨噬細(xì)胞，上調(diào)巨噬細(xì)胞表面分布的MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ協(xié)同刺激分子CD80/86等的表達(dá)程度，使巨噬細(xì)胞內(nèi)的依賴性和非依賴性氧殺菌系統(tǒng)充分激活，使巨噬細(xì)胞獲得了溶解消化胞內(nèi)微生物的能力。與此同時(shí)，巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力得到進(jìn)一步強(qiáng)化，從而進(jìn)一步地強(qiáng)化了對(duì)結(jié)核桿菌的免疫功能。從以上的理論基礎(chǔ)不難看出結(jié)核性胸膜炎與IFN-γ之間存在著密切的聯(lián)系。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道顯示測(cè)定胸水中IFN-γ濃度對(duì)診斷結(jié)核性胸膜炎具有較高的價(jià)值。如Villena等[5]，進(jìn)行了包括595例患者，涵蓋結(jié)核因素、惡性腫瘤、細(xì)菌感染、血管炎性、非干酪樣肉芽腫、免疫損傷和器官移植排斥等多種因素在內(nèi)的多項(xiàng)研究，結(jié)果顯示胸腔積液中的IFN-γ含量水平在結(jié)核性胸膜炎診斷中具有非常高的意義，并確定了放免法胸腔積液中IFN-γ的cutoff值為3.7 kU/L，在此cutoff值下，敏感性和特異性均為98%。

然而，絕大多數(shù)研究是以ELISA、放免等方法測(cè)定胸腔積液中IFN-γ濃度，檢測(cè)的是無(wú)生命的溶液中細(xì)胞因子的濃度，近年來(lái)，ELISPOT方法對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。不少研究發(fā)現(xiàn)利用結(jié)核特異性抗原如ESAT-6，CFP10刺激后，檢測(cè)產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞的診斷方法對(duì)結(jié)核感染人群具有較高的敏感性和特異性，特別是對(duì)潛伏性結(jié)核，兒童結(jié)核病等特殊人群。Lalvani等[8]也認(rèn)為該方法的敏感率達(dá)到了95%。而本實(shí)驗(yàn)采取的ELISPOT方法檢測(cè)的便是T細(xì)胞分泌IFN-γ的功能，作為功能性檢測(cè)，能直接反映細(xì)胞免疫功能。該檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)也已開(kāi)始進(jìn)入試驗(yàn)性診斷應(yīng)用階段，但對(duì)于國(guó)人常見(jiàn)的結(jié)核性胸膜炎卻無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用ELISPOT檢測(cè)法，用結(jié)核特異性抗原A肽，B肽作刺激物，檢測(cè)胸水中對(duì)結(jié)核特異性抗原刺激有所反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞的陽(yáng)性率來(lái)探討此方法對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值.這是一個(gè)新的嘗試，但樣本量較小也是本研究需要改進(jìn)之處。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性組T細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性率明顯高于惡性腫瘤組，提示T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ在結(jié)核性胸膜炎發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，這與過(guò)去的研究結(jié)果是相一致的，因此測(cè)定T細(xì)胞靈敏度較高的EISPOT檢測(cè)如果應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎的診斷中，對(duì)結(jié)核性胸膜炎的及時(shí)治療有一定的幫助[9-11]，可以減少胸膜增厚，膿胸等并發(fā)癥。同時(shí)對(duì)于由結(jié)核菌引起的其他漿膜腔積液疾病如結(jié)核性腦膜炎，結(jié)核性腹膜炎的診斷也將是新的借鑒。

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Clinical application value of ELISPOT in the diagnosis of tuberculous pleuritis

DONG Xuan1LI Tianxing2HAN Xiaoqun3HUANG Hanping4
1.Department of Tuberculous Meningitis,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China; 2.Department of Thoracic Surgery,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China;3.Department of Infectious Disease,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China;4.Department of Respiratory Tuberculosis,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China

ObjectiveTo investigate the clinical application value of ELISPOT in the diagnosis of tuberculous pleuritis.Methods 21 patients with tuberculous pleuritis in Wuhan Medical Treatment Center from August 2011 to August 2012 were selected as tuberculosis group,18 patients with lung cancer and pleural metastasis were selected as malignant tumor group.ELISPOT method was used to detect the pleural effusion,peripheral blood in tuberculosis group and pleural effusion in malignant tumor group;the tuberculosis specific antigen stimulation reactions was observed;the positive rate of T lymphocyte with secreting gamma interferon were observed.ResultsT lymphocyte testing positive rate in tuberculosis group 85.7%(18/21),significant higher than that of tuberculosis group[16.7%(3/18)]according to the ELISPOT results,the difference was statistically significant(P＜0.05).The sensitivity and specificity of ELISPOT were 85.7% and 83.3%repectively.ConclusionELSPOT is a sensitive and specific detection method of tuberculosis pleuritis,it has clinical diagnostic value.

Tuberculous pleuritis;ELISPOT;Diagnosis

R446.61

A

1673-7210（2014）03（b）-0091-03

2013-11-21本文編輯：任念）

湖北省武漢市衛(wèi)生局科研課題（編號(hào)WX12C15）。

董璇（1976.10-），女，湖北武漢人，碩士；研究方向：結(jié)核呼吸。