蝎肽抗菌凝膠對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用

朱占永 余墨聲 劉思洋 趙月強(qiáng) 楊希林 曾鳳華 曹志賤

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院燒傷整形外科，湖北武漢430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻喉科，湖北武漢430060；3.青海省人民醫(yī)院整形外科，青海西寧810007；4.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070

蝎肽抗菌凝膠對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用

朱占永1余墨聲1劉思洋1趙月強(qiáng)1楊希林2曾鳳華3曹志賤4

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院燒傷整形外科，湖北武漢430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻喉科，湖北武漢430060；3.青海省人民醫(yī)院整形外科，青海西寧810007；4.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070

目的研究蝎肽抗菌凝膠對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用。方法將2種編號的痤瘡丙酸桿菌厭氧培養(yǎng)，采用微量稀釋法對稀釋后的痤瘡丙酸桿菌菌株的培養(yǎng)菌液進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，向稀釋后的菌液中分別加入無菌生理鹽水、不同濃度的蝎肽抗菌凝膠和含有氨芐青霉素鈉粉針劑的溶液，用酶標(biāo)儀和顯微鏡觀察其對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用結(jié)果；用平板培養(yǎng)的方法復(fù)測蝎肽抗菌凝膠的最小抑菌濃度。結(jié)果加入蝎肽抗菌凝膠后的前6組痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)溶液和加入含有氨芐青霉素鈉粉針劑的溶液中均未發(fā)現(xiàn)有痤瘡丙酸桿菌的生長，顯微鏡下也未見有痤瘡丙酸桿菌生長，其中蝎肽抗菌凝膠對2種痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度分別為3.125 μg/mL和6.25 μg/mL。結(jié)論蝎肽抗菌凝膠對痤瘡丙酸桿菌有明顯的抑制作用，為臨床上尋常型痤瘡疾病的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蝎肽；抗菌凝膠；痤瘡丙酸桿菌；抑制作用

痤瘡作為一種有損容危害的疾病來講，不僅影響患者的外貌，而且嚴(yán)重影響患者的身心健康，因而有關(guān)痤瘡治療方面的研究一直受到較多國內(nèi)外研究者的關(guān)注。許多相關(guān)的研究表明，痤瘡患者的皮損處和毛囊導(dǎo)管內(nèi)存在著大量的痤瘡丙酸桿菌［1］，因而研究如何抑制痤瘡丙酸桿菌在創(chuàng)面的繁殖對臨床上治療痤瘡有著非常重要的意義。本研究應(yīng)用含有蝎肽抗菌毒素小分子多肽的凝膠制劑(歇肽抗菌凝膠)作用于痤瘡丙酸桿菌的菌株，觀察歇肽抗菌凝膠對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用，為痤瘡的臨床治療提供初步的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株購自中國典型培養(yǎng)物種保藏中心的2個(gè)痤瘡丙酸桿菌菌株，(編號AB6919、AB11827)。

1.1.2 試驗(yàn)藥物武漢摩爾有限公司提供的歇肽抗菌凝膠臨床應(yīng)用制劑，無菌生理鹽水和氨芐青霉素鈉粉針劑。

1.1.3 儀器和試劑酶標(biāo)儀biotech ELX800，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，BS110S型電子天平，高壓滅菌鍋，厭氧發(fā)生袋，BHI粉，厭氧發(fā)生劑：MGC Anaero Pack.Anaero，厭氧指示劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 痤瘡丙酸桿菌的培養(yǎng)稱取37 g生物合成人胰島素(BHI)粉末溶于1 L水中，滅菌后制成BHI培養(yǎng)基，將兩株痤瘡丙酸桿菌菌株分別接種到BHI培養(yǎng)基中，在厭氧發(fā)生袋中37℃厭氧培養(yǎng)48 h并振搖均勻備用。另取少量菌珠涂于載玻片上，采用革蘭染色的方法固定染色，然后將其置于100×100的油鏡下執(zhí)行鏡檢，鏡下可見紫色桿菌，微彎呈棒狀或桿狀，無雜菌生長(圖1)。

圖1 痤瘡丙酸桿菌

1.2.2 倍比稀釋蝎肽抗菌凝膠溶液將兩種菌株培養(yǎng)的溶菌溶液稀釋100倍(OD600約為0.002)；將1 mg/mL的蝎肽抗菌凝膠溶液進(jìn)行倍比稀釋：取8支滅菌試管并各加入蒸餾水1.0 mL，取蝎肽抗菌凝膠溶液1.0 mL加入第1管中，充分混勻后取1.0 mL加入第2管，以此類推，第8管中取1.0 mL液體并將其棄去(表1)。

表1 藥物稀釋度和相應(yīng)藥物含量

1.2.3 菌株和藥液培養(yǎng)向無菌96孔板中每孔加入上述稀釋的含有痤瘡丙酸桿菌的溶液80 μL，再加入稀釋的藥物溶液20 μL，使得藥物終濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 μg/mL，以80 μL菌液加20 μL無菌生理鹽水作為陰性對照。陽性對照是由80 μL菌液加20 μL高濃度(25 μg/mL)的氨芐青霉素鈉溶液組成。將上述標(biāo)本轉(zhuǎn)移入恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱37℃，250 r/min厭氧培養(yǎng)40～48 h。

1.2.4 細(xì)菌生長情況的檢測用酶標(biāo)儀測定每組試管藥物與痤瘡丙酸桿菌混合后溶液OD600的吸光值。已完全沒有光吸收孔的藥物濃度作為最小抑制濃度。取沒有光吸收的菌液常規(guī)行革蘭染色后用顯微鏡檢查來證明有無痤瘡丙酸桿菌的生長。

1.2.5 最小抑菌濃度的檢測采用平板培養(yǎng)復(fù)測的方法檢測出針對兩種型號痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度值。

2 結(jié)果

編號為AB6919的菌株培養(yǎng)菌液和6號試管的藥液混合培養(yǎng)后，沒有發(fā)現(xiàn)有光吸收；編號AB11827的菌株培養(yǎng)菌液和5號試管藥液混合培養(yǎng)后，也沒有發(fā)現(xiàn)有光吸收，分別取沒有光吸收時(shí)的混合溶液常規(guī)行革蘭染色處理后顯微鏡下檢查時(shí)未見有細(xì)菌生長；通過平板培養(yǎng)復(fù)測的方法得出蝎肽抗菌凝膠對兩種菌株內(nèi)的痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別是3.125 μg/mL(菌株編號AB6919)和6.25 μg/mL(菌株編號AB11827)(圖2)。

圖2 平板培養(yǎng)復(fù)測的方法檢測蝎肽抗菌凝膠對2種型號痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度值

3 討論

痤瘡丙酸桿菌屬于專性厭氧或微需氧的菌種，同時(shí)丙酸桿菌屬的革蘭陽性類白喉?xiàng)U菌，是皮膚上的優(yōu)勢菌群。現(xiàn)代研究認(rèn)為，痤瘡丙酸桿菌的生長主要依靠皮脂中的三酰甘油作為營養(yǎng)元素，通過獲取其甘油的部分作為自身能量的來源，而去酯化的脂肪酸殘留于皮脂中并且含量與細(xì)菌的數(shù)量成正比，去酯化的游離脂肪酸可明顯刺激毛囊皮脂腺開口處上皮的增生和角化過度，另外由痤瘡丙酸桿菌本身產(chǎn)生的一些低分子多肽可驅(qū)化體內(nèi)的中性粒細(xì)胞，后者產(chǎn)生的水解酶也可使毛囊壁損傷破裂，因而造成上述各種毛囊的內(nèi)容物溢入到真皮內(nèi)而引起毛囊周圍程度不等的深部炎癥并促進(jìn)皮脂腺過多分泌，使皮脂排泄不暢［1.2］；以上發(fā)生在體內(nèi)的變化明顯促進(jìn)了痤瘡丙酸桿菌及其他革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等的繁殖，導(dǎo)致炎癥性丘疹、膿皰的產(chǎn)生［3］，因此抑制痤瘡丙酸桿菌對治療尋常型痤瘡是相當(dāng)重要的。隨著痤瘡丙酸桿菌耐藥性問題的日益明顯，從而導(dǎo)致了藥物療效的明顯降低。目前口服或外用抗生素類藥物治療炎癥性損害療效差的主要原因是患者用藥的依從性差、劑量不夠、療程不足、出現(xiàn)革蘭陽性菌毛囊炎、痤瘡丙酸桿菌耐藥和皮脂分泌過多［4］。治療痤瘡使用外用藥后，皮損局部藥物濃度通常明顯高于全身用藥，而且皮損周邊藥物濃度明顯低于皮損中央，更易產(chǎn)生耐藥性［5］，故在對于治療痤瘡過程中，細(xì)菌的耐藥性成了一個(gè)需要克服的難題。

實(shí)驗(yàn)中所用的蝎肽抗菌凝膠是一種新型抗菌凝膠，其有效抗菌成分為蝎毒素多肽，該多肽具有廣泛的抗菌譜，能有效殺滅革蘭陽性球菌，尤其對耐甲氧西林金葡菌(methicillin.resistant staphylococcus aureus，MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin.resistant coagulase negative staphylococcus，MRCNS)有較強(qiáng)殺滅作用，且不易產(chǎn)生耐藥性［6.7］，這些細(xì)菌也都是尋常型痤瘡的主要致病菌。在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了蝎肽抗菌凝膠對尋常痤瘡的主要致病菌痤瘡丙酸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，蝎肽抗菌凝膠對兩種菌株內(nèi)的痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別是3.125 μg/mL (菌株編號AB6919)和6.25 μg/mL(菌株編號AB11827)。結(jié)合前面所提到的蝎肽抗菌凝膠制劑針對抑制的細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，可以得出：蝎肽抗菌凝膠在治療尋常型痤瘡方面將具有顯著的臨床療效，本實(shí)驗(yàn)為尋常型痤瘡的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Gollnick H.Current concepts of the pathogenesis of acne［J］. Drugs，2003，63(15)：1579.1596.

［2］Patel M，Bowe WP，Heughebaert C，et al.The development of antimicrobial resistance due to the antibiotic treatment of acne vulgaris：a review［J］.J Drugs Dermatol，2010，9(6)：655.664.

［3］孫兵，吳元輝，龐云龍.尋常痤瘡細(xì)菌學(xué)分析［J］.人民軍醫(yī)，1999，42(1)：48.49.

［4］Tan HH.Antibacterial therapy for acne：a guide to selection an d use of systemic agents［J］.Am J Clin Derm Atol，2003，4(5)：307.314.

［5］Eady EA，Jones CE，Tipper JL，et al.Antibiotic resistant prepionibacteria in acne：need for policies to modify antibiotic usage［J］.BMJ，1993，306(6877)：555.556.

［6］Zhao Z，Ma Y，Dai C，et al.Imcroporin，a new cationic antimicrobial peptide from the venom of the scorpion isometrusmaculates［J］.AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2009，53(8)：3472.3477.

［7］Dai C，Ma Y，Zhao Z，et al.Mucroporin，the first cationic host defence peptide from the venom of Lychas mucronatus［J］. Antimicrob Agents Chemother，2008，52(11)：3967.3972.

The inhibition of scorpion antimicrobial peptide gel on propionibacterium acnes

ZHU Zhanyong1YU Mosheng1LIU Siyang1ZHAO Yueqiang1YANG Xilin2ZENG Fenghua3CAO Zhijian41.Department of Orthopedics,the People′s Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China; 2.Department of Otolaryngology,the People′s Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China; 3.Department of Orthopaedics,the People′s Hospital of Qinghai Province,Xining810007,China;4.College of Life Science,Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China

Objective To research the inhibition of scorpion antimicrobial peptide gel on propionibacterium acnes（P.acnes）.Methods Two kinds of number P.acnes were anaerobic cultivation,diluted bacteria cultivation liquid of the P.acnes did drug sensitive test by the trace dilution method.The sterile saline,different concentrations of scorpion peptide gel solution and sodium ampicillin powder injection solution were added into the diluted bacterium fluid respectively.The inhibition of difference concentrations of scorpion antimicrobial peptide gel on P.acnes by means of Enzyme standard instrument and microscope were observed.Results The first six P.acnes culture solution groups of being add in scorpion antimicrobial peptide gel and sodium ampicillin powder injection had not been found the growth of P.acnes,the growth of the P.acnes had not been observed under the microscope too.The minimum inhibition concentration of the scorpion antimicrobial peptide gel were 3.125 μg/mL and 6.25 μg/mL respectively.Conclusion The growth of P.acnes is obviously inhibited by scorpion antimicrobial peptide gel,this result provides a reliable experimental basis for the clinical treatment of acne vulgaris.

Scorpion peptide;Antimicrobial gel;Propionibacterium acnes;Inhibition

R758.733

A

1673-7210（2014）02（a）-0043-03

2013.11.01本文編輯：張瑜杰)

湖北省武漢市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(編號2013 060602010275)。

朱占永(1981.9.)，男，博士，主要從事蝎肽抗菌凝膠抗菌機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究。

余墨聲(1961.11.)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事蝎肽抗菌凝膠抗菌機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究。