巴桑母酥油丸對(duì)放射線-化學(xué)復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后重建造血能力的影響

降央澤仁 黃茜 黃曉芹

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川成都611137

巴桑母酥油丸對(duì)放射線-化學(xué)復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后重建造血能力的影響

降央澤仁1黃茜1黃曉芹2

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川成都611137

目的研究藏藥巴桑母酥油丸對(duì)放射線.化學(xué)復(fù)合損傷后機(jī)體骨髓造血干細(xì)胞功能的影響，探究其“補(bǔ)益”作用機(jī)制。方法將經(jīng)60Co γ射線照射+環(huán)磷酰胺腹腔注射方法得到的放射線.化學(xué)復(fù)合損傷小鼠分為巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組，分別灌胃巴桑母酥油丸、生理鹽水及自然恢復(fù)14 d后，將其骨髓作為供體移植給受致死劑量γ射線照射的同種受體小鼠，再檢測(cè)受體小鼠外源性脾集落、骨髓造血祖細(xì)胞集落產(chǎn)率、骨髓細(xì)胞造血干細(xì)胞抗原.1(Sca.1)陽性細(xì)胞率，并與灌胃。結(jié)果巴桑母酥油丸組的外源性脾集落、骨髓早期紅系祖細(xì)胞集落(BFU.E)、粒.巨噬系祖細(xì)胞集落(CFU.GM)產(chǎn)率均顯著高于空白組和生理鹽水組(P＜0.05)，而晚期紅系祖細(xì)胞集落(CFU.E)、巨核系祖細(xì)胞集落(CFU.Meg)、骨髓細(xì)胞Sca.1+細(xì)胞率并不高于自然恢復(fù)的空白組(P＞0.05)。結(jié)論巴桑母酥油丸可以提高放射線.化學(xué)復(fù)合損傷小鼠骨髓造血干細(xì)胞移植后造血重建能力，提示巴桑母酥油丸可經(jīng)改善骨髓造血干細(xì)胞功能發(fā)揮其對(duì)放射線.化學(xué)復(fù)合損傷機(jī)體“補(bǔ)益”作用。

巴桑母酥油丸；放-化療；造血干細(xì)胞；骨髓移植；造血重建；補(bǔ)益

造血功能抑制(骨髓抑制)是放、化療最嚴(yán)重、最根本的毒副作用，其降低了患者生存質(zhì)量，并直接影響到治療效果和生存率。筆者前期工作顯示，藏醫(yī)經(jīng)典滋補(bǔ)方“巴桑母酥油丸”可促進(jìn)放射線.化學(xué)復(fù)合損傷小鼠外周血象的恢復(fù)［1］。本實(shí)驗(yàn)擬通過同種異體小鼠骨髓移植方法，比較研究灌胃巴桑母酥油丸、生理鹽水及自然恢復(fù)的放射線.化學(xué)復(fù)合損傷小鼠骨髓造血干細(xì)胞在正常受體小鼠體內(nèi)重建造血的能力，以探究巴桑母酥油丸對(duì)放射線.化學(xué)復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞的功能干預(yù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體級(jí)8～12周齡雄性C57BL6J小鼠60只，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2009.09，購(gòu)買于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，18～22 g。

1.2 藥品和試劑

巴桑母酥油丸(Basangmu Suyou Wan，西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司，批號(hào)：101201)，生理鹽水稀釋溶解至所需濃度，4℃貯存?zhèn)溆?，用前加熱混勻；PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠造血干細(xì)胞抗原.1抗體［PE anti.mouse Ly.6A/E(Sca.1)，美國(guó)BioLegend，批號(hào)：108107］；同型對(duì)照：Rat IgG2a，κ(美國(guó)BioLegend，批號(hào)：400507)；

1.3 儀器設(shè)備

60Co γ源(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所輻照中心)；MCD.15A.CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；CX.10.倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；ELITE ESP.流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 放射線-化學(xué)復(fù)合損傷小鼠模型建立及分組采用本室60Co γ射線照射+環(huán)磷酰胺腹腔注射的常規(guī)方法［2］制造放射線.化學(xué)復(fù)合損傷(以下簡(jiǎn)稱放.化復(fù)合損傷)小鼠模型30只，于造模完成后第2天隨機(jī)分為巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組，每組10只(供體小鼠)，巴桑母酥油丸組小鼠每日灌胃1.5 g/kg的藥物(與前期研究一致)，生理鹽水組灌胃同體積生理鹽水(0.1 mL)，1次/d，持續(xù)14 d，最后一次灌胃24 h后處死小鼠，無菌條件下分離骨髓細(xì)胞(BMC)進(jìn)行后續(xù)操作。自然恢復(fù)的空白組不予以灌胃，同等條件下飼養(yǎng)14 d后分離骨髓細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 骨髓移植及脾集落分析30只正常小鼠(受體小鼠)，經(jīng)60Co γ射線9 Gy照射后，經(jīng)尾靜脈注入“1.4.1”項(xiàng)下分離的各組骨髓細(xì)胞(5×104個(gè)/只)，注射9 d后殺鼠分離脾臟，用Bousin氏液固定24 h后用氨酒精脫色，肉眼計(jì)數(shù)脾集落數(shù)。

二是次要關(guān)系。旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情系統(tǒng)中的主客系統(tǒng)與外圍因素之間的互動(dòng)形成了除主客關(guān)系外的次要關(guān)系。旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情系統(tǒng)中的外圍因素雖然沒有顯著作用于系統(tǒng)內(nèi)的輿情主體、輿情客體以及傳播媒介，但起到了重要的環(huán)境變量的作用，從而形成了外圍因素與主客系統(tǒng)之間的互動(dòng)關(guān)系，構(gòu)成了旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情系統(tǒng)中的次要關(guān)系。由政治、經(jīng)濟(jì)、文化、制度以及技術(shù)等因素共同形成的環(huán)境從宏觀層面影響著旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情的發(fā)展與演化，因此，不能忽略外圍環(huán)境因素在旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情系統(tǒng)中發(fā)揮的作用。主要關(guān)系與次要關(guān)系都是客觀存在的，且二者相輔相成，共同構(gòu)成旅游危機(jī)事件網(wǎng)絡(luò)輿情系統(tǒng)。

1.4.3 骨髓祖細(xì)胞集落產(chǎn)率分析無菌分離受體小鼠一側(cè)股骨骨髓細(xì)胞，常規(guī)進(jìn)行體外半固體體骨髓早期紅系祖細(xì)胞集落(BFU.E)、晚期紅系祖細(xì)胞集落(CFU.E)、粒.巨噬系祖細(xì)胞集落(CFU.GM)、巨核系祖細(xì)胞集落(CFU.Meg)培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.4.4 骨髓Sca-1免疫表型陽性（Sca-1+）細(xì)胞數(shù)檢測(cè)用磷酸緩沖液(PBS)洗滌分離的受體小鼠另一側(cè)股骨骨髓細(xì)胞，調(diào)骨髓細(xì)胞為≥1×106個(gè)/mL，取100 μL樣品加入上機(jī)試管底部，加入單克隆抗體20 μL，混勻，室溫避光孵育20 min，加入500 μL紅細(xì)胞裂解液充分混勻，室溫靜置20 min，加入500 μL PBS液，充分混勻，上機(jī)檢測(cè)(先做同型對(duì)照，設(shè)立陰陽性分界線后再做Sca.1檢測(cè))，以散點(diǎn)圖顯示陽性細(xì)胞百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 巴桑母酥油丸對(duì)放-化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后形成脾集落和骨髓祖細(xì)胞集落能力的影響（±s，n=10）

表1 巴桑母酥油丸對(duì)放-化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后形成脾集落和骨髓祖細(xì)胞集落能力的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，☆P＜0.05；與生理鹽水組比較，★P＜0.05

組別脾集落(個(gè)/脾) B F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . E ( / 5 × 410B M C ) C F U . G M ( / 5 × 410B M C ) C F U . M e g ( / 5 × 410B M C )空白組生理鹽水組巴桑母酥油丸組1 7 . 2 0 ± 2 . 2 5 1 5 . 5 0 ± 3 . 0 3 2 0 . 1 0 ± 2 . 8 0☆★1 4 . 0 0 ± 1 . 7 9 1 5 . 0 0 ± 2 . 7 6 1 8 . 6 7 ± 3 . 2 7☆★2 4 . 3 3 ± 4 . 6 3 2 1 . 3 5 ± 3 . 2 6 2 8 . 6 7 ± 3 . 2 7★2 6 . 0 0 ± 3 . 5 8 2 4 . 3 3 ± 4 . 9 7 3 2 . 0 0 ± 2 . 8 3☆★5 . 3 1 ± 0 . 8 2 4 . 2 3 ± 1 . 0 3 6 . 3 4 ± 1 . 5 0★

2.1 巴桑母酥油丸對(duì)放-化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后形成脾集落能力的影響

各組供體小鼠骨髓細(xì)胞移植后，受體小鼠外源性脾集落產(chǎn)率見表1。結(jié)果顯示，移植巴桑母酥油丸組、生理鹽水組、空白組的小鼠脾集落產(chǎn)率分別為(20.10± 2.80)，(15.50±3.03)，(17.20±2.25)個(gè)/脾，巴桑母酥油丸組顯著高于其余兩組(P＜0.05)。

2.2 巴桑母酥油丸對(duì)放-化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后形成骨髓祖細(xì)胞集落能力的影響

2.3 巴桑母酥油丸對(duì)放-化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)骨髓Sca-1+細(xì)胞數(shù)的影響

各組供體小鼠骨髓細(xì)胞移植后，受體小鼠骨髓Sca.1+細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖1～2。結(jié)果顯示，接受各供體組小鼠骨髓移植的受體小鼠，其骨髓中Sca.1+細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1各組受體小鼠骨髓細(xì)胞Sca-1+細(xì)胞率檢測(cè)

圖2 巴桑母酥油丸對(duì)受體小鼠骨髓Sca-1+細(xì)胞率的影響

3 討論

在血細(xì)胞的發(fā)生過程中，造血干細(xì)胞與造血微環(huán)境間的關(guān)系就似“種子”和“土壤”的關(guān)系［3.4］。受致死劑量γ射線輻射后，受體的造血功能被摧毀［5］，此時(shí)接受骨髓移植后，供體的造血干細(xì)胞在受體體內(nèi)經(jīng)過歸巢、增殖、分化，從而重建受體的造血功能，在受體機(jī)體狀況完全一致的情況下，重建造血的結(jié)果主要取決于所接受的造血干細(xì)胞［6］，檢測(cè)的造血相關(guān)指標(biāo)可以反映出不同供體間造血干細(xì)胞的功能差異。

造血干細(xì)胞通過不對(duì)稱分裂的形式，即分裂后形成一個(gè)保留干細(xì)胞全部特點(diǎn)的子代細(xì)胞和一個(gè)可以進(jìn)一步分裂分化成為其他后續(xù)造血細(xì)胞的子代細(xì)胞，維持自己數(shù)量的相對(duì)恒定(自我更新)，這是其重建受體永久性造血的基礎(chǔ)，也是制約其數(shù)量擴(kuò)增而功能不分化的原因［7］。Sca.1+被認(rèn)為是小鼠造血干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［8.9］，同時(shí)造血干細(xì)胞的自我更新以及定向分化，尤其是向巨核系分化、血小板形成需要Sca.1抗原的參與［10］。實(shí)驗(yàn)中灌胃巴桑母酥油丸提高了放化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞在受體小鼠脾臟分裂、分化為脾集落的能力和在骨髓向粒.巨噬系、紅系造血定向分化的能力，但對(duì)骨髓Sca.1+細(xì)胞率的改變和造血干細(xì)胞向巨核系分化沒有促進(jìn)作用，提示巴桑母酥油丸具有促進(jìn)放化復(fù)合損傷小鼠造血干細(xì)胞在受體體內(nèi)重建紅系、粒.巨噬系造血的能力。由于除骨髓外，脾臟也是小鼠重要的造血器官［11］，并是骨髓移植后巨核系造血的重要場(chǎng)所［12］，巴桑母酥油丸可否增加脾臟Sca.1+細(xì)胞數(shù)或促進(jìn)脾臟造血干細(xì)胞向巨核系方向分化有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Basangmu Suyou Wan on hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice

Jiangyangzeren1HUANG Qian1HUANG Xiaoqin21.Preclinical School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137,China; 2.Ethnomedicine School,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Province,Chengdu611137, China

Objective To research the effect of the traditional Tibetan drug,Basangmu Suyou Wan,on the function of hematopoietic stem cells in bone marrow after combined radiation and chemical injury,and explore the tonic mechanism.Methods Combined radiation and chemical injured mice,which received60Co γ.irradiation and intraperitoneal injection of cyclophosphamide,were randomly divided into three groups.The Basangmu Suyou Wan group and saline group were gavaged with Basangmu Suyou Wan and saline for 14 days,respectively.Non.gavaged mice were used as blank control.Bone marrow cells from all mice as donors were transplanted into recipient mice exposed to a lethal dose of γ.irradiation.The spleen colony forming unit（CFU.S）,bone marrow hematopoietic progenitor colony proportion and hematopoietic stem antigen.1（Sca.1）positive cell proportion of recipient mice were tested after transplantation. Results In recipient mice which received transplantation from Basangmu Suyou Wan group,the CFU.S,bone marrow earlier period erythropoieted progenitor colony（BFU.E）and granulocyte.macrophage colony forming unit（CFU.GM）reached levels significantly higher than mice given donations from blank group and saline group（P＜0.05）,while the later period of erythropoited progenitor colony（CFU.E）,megakaryocyte colony forming unit（CFU.Meg）and Sca.1+cell proportion were not more than the blank group（P＞0.05）.Conclusion Basangmu Suyou Wan enhances hematopoietic reconstitution ability after hematopoietic stem cell transplantation in combined radiation and chemical injured mice, thus indicating it can exert tonic effect in the combined radiation and chemical injured body by improving the hematopoietic stem cell function in bone marrow.

Basangmu Suyou Wan;Radiochemotherapy;Hematopoietic stem cell;Bone marrow transplantation; Hematopoietic reconstitution;Tonic

R285.5

A

1673-7210（2014）02（a）-0038-03

2013.11.01本文編輯：衛(wèi)軻)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)81072893)。

黃曉芹，博士，教授，主要從事中(藏)西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。