COPD患者肺組織中CTGF表達水平增加

周思靜，李 敏，王 苒，許 銳，費黎明，祝清清，張 燕

(1.合肥市第三人民醫(yī)院職業(yè)病科，安徽合肥230001;2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科安徽合肥230001;3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽合肥230001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎性反應為特征［1］。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種新發(fā)現的生長因子，近年來，有研究結果表明，結締組織生長因子還參與調節(jié)多種炎性反應［2］。本研究探討COPD 的肺組織中CTGF 表達差異，為研究吸煙人群的COPD易患機制提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料:肺組織標本來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科2012年1月至2012年12月因肺部占位性病變行肺葉切除術的患者。將標本分為3 組(每組25 例):1)吸煙+COPD 組:均為吸煙的COPD 患者，均符合COPD 的診斷標準，且處于穩(wěn)定期。2)吸煙組:均為未患COPD 的吸煙者。3)對照組:均無職業(yè)性粉塵與化學物質接觸式，均無吸煙史，且未患COPD。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的審查和批準，在采集標本前均告知研究對象，并獲得其本人同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑:兔抗人CTGF 多克隆抗體、小鼠抗人-肌動蛋白抗體(Santa Cruz 公司)，Trizol 試劑(Invitrogen 公司)，反轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒(Toyobo 公司)，SDS-PAGE 試劑盒、組織蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白標志物(Fenmentas 公司)。所有引物均由上海生工生物工程公司設計合成。

1.2.2 采集組織標本:收集行肺葉切除手術后的肺組織標本，所取標本均遠離病變(＞5 cm)，且肉眼觀察無癌組織浸潤。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測mRNA 表達:定量PCR 的結果采用2－ΔΔCt法來測定目的基因的相對表達。

1.2.4 免疫組化:石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，用兔抗人CTGF多克隆抗體作為一抗(Santa Cruz Biotechnology)，稀釋度為1∶200。按試劑盒說明書操作。

1.2.5 Western blot 蛋白表達:取肺組織加入組織蛋白提取試劑，取等量蛋白上樣，以β-actin 為內參照，用10%的SDSPAGE 凝膠電泳后，截取含CTGF 蛋白和β-actin 蛋白的凝膠，將蛋白電轉至硝酸纖維素膜后，加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入相應的二抗孵育，洗膜后顯影，用Quantity One 軟件處理系統(tǒng)分析各條帶的吸光度值(A)，計算蛋白相對表達量(CTGF/內參的吸光度比值)。

1.3 統(tǒng)計學:采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q 檢驗，計數資料比較采用卡方檢驗，相關性檢驗采用Pearson 相關分析方法。

2 結果

2.1 臨床資料比較:吸煙+COPD 組的FEV1 占預計值百分比、FEV1/FVC 均顯著低于對照組和吸煙組(表1)。

表1 各組研究對象臨床資料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

表1 各組研究對象臨床資料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

＊P＜0.05 compared with control and smoker.

groupFEV1 pred(%，images/BZ_3_296_691_329_735.png±s)FEV1/FVC(%)control104.5 ±13.781.2 ±5.3 smoker93.3 ±11.279.8 ±7.8 smoker+COPD74.6 ±10.4*63.1 ±6.1*

2.2 肺組織中CTGF 的mRNA 的表達:吸煙+COPD 組研究對象肺組織中CTGFmRNA 表達水平為4.28 ±0.43，高于吸煙組的(2.45 ±0.37，P＜0.05)，而吸煙組又高于不吸煙對照組的(1.02 ±0.15，P＜0.05)。

2.3 肺組織中CTGF 的表達:CTGF 表達于肺泡上皮細胞、小血管平滑肌細胞的細胞質中(圖1)。

圖1 肺組織中CTGF 的表達。Fig 1 CTGF expression in lung tissues (×400)

2.4 肺組織中CTGF 的蛋白表達:吸煙+COPD 組肺組織的CTGF 的蛋白表達為3.07 ±0.42 顯著高于吸煙組的1.74 ±0.26(P＜0.05)和對照組的0.61 ±0.11(P＜0.05)。

2.5 CTGF 表達與肺功能的相關性:肺組織中CTGFmRNA表達量與FEV1 占預計值%和FEV1/FVC 均呈負相關(P＜0.05);肺組織中CTGF 的蛋白表達量與FEV1 占預計值%和FEV1/FVC 均呈負相關(P＜0.05)。

圖2 Western blot 法檢測各組肺組織中CTGF 的蛋白表達Fig 2 CTGF protein expression in lung tissues from groups using Western blot

3 討論

吸煙是目前公認的導致COPD 發(fā)病的最重要危險因素，但僅有少部分吸煙者罹患COPD，提示吸煙者自身易感因素存在差異。有相關研究表明，結締組織生長因子CTGF 廣泛參與炎性細胞的募集或血管生成，進而在炎性反應中發(fā)揮作用［3］。

本研究顯示，在吸煙組的肺組織中，CTGF 的mRNA 和蛋白表達較少，但吸煙+COPD 組的肺組織中CTGF 的mRNA和蛋白表達明顯增加(圖2)，提示CTGF 可能參與COPD 的炎性反應。CTGF 的mRNA 和蛋白表達水平還與肺部氣流受限存在正相關關系，提示CTGF 升高與吸煙導致的肺部慢性炎性反應有一定關系。CTGF 參與吸煙誘導的COPD 患者慢性肺部炎性反應的機制，可能與CTGF 促進和激活TNF、IL-6、IL-8 和MCP1 等炎性因子和趨化因子的生成［4］、增加炎性細胞趨化性、附著性有關。

總之，本研究證實，CTGF 在肺組織中的表達與肺功能呈負相關，吸煙的COPD 患者肺組織中CTGF 表達明顯高于吸煙未患COPD 者，提示CTGF 在肺組織中的表達與COPD 有一定相關性，但CTGF 的表達和吸煙致COPD 的發(fā)病是否存在一定程度的因果關系尚需進一步闡明，本研究結果為進一步研究CTGF 在吸煙致COPD 發(fā)病機制中的作用提供了前期理論依據，值得進一步探討。

［1］Chung KF and Adcock IM.Multifaceted mechanisms in COPD:inflammation，immunity，and tissue repair and destruction［J］.Eur Res J，2008，31:1334-1356.

［2］Kular L，Pakradouni J，Kitabgi P，et al.The CCN family:a new class of inflammation modulators?［J］.Biochimie，2011，93:377-88.

［3］Bai T，Chen CC，Lau LF.Matricellular protein CCN1 activates a proinflammatory genetic program in murine macrophages［J］.J Immunol，2010，184:3223-3232.

［4］Wang X，McLennan SV，Allen TJ，et al.Regulation of pro-inflammatory and pro-fibrotic factors by CCN2/CTGF in H9c2 cardiomyocytes［J］.J Cell Commun Signal，2010，4:15-23.