Notch和HES蛋白表達(dá)在大鼠靜脈橋狹窄中的作用

魏小棟，肖永光

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心胸外科，湖北恩施445000;2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，湖北武漢430062)

自體靜脈因其取材方便、操作相對簡單，常作為外科治療冠心病和外周動脈狹窄的首選材料。但此類手術(shù)后靜脈橋遠(yuǎn)期療效不佳，5年通暢率僅為30%，導(dǎo)致遠(yuǎn)端血供重新受到影響，嚴(yán)重者甚至需要再次手術(shù)治療［1］。研究表明，影響術(shù)后靜脈橋再次狹窄的主要原因是中層血管平滑肌細(xì)胞的大量增生并分泌大量的細(xì)胞基質(zhì)在管壁堆積，造成管壁增厚、彈性減弱［2］。但血管平滑肌細(xì)胞增生和分泌大量細(xì)胞基質(zhì)的病理機(jī)制目前卻尚不清楚［3］。

Notch 是一個(gè)非常保守的信號通路，其一共有4個(gè)受體(Notch1、2、3、4)和5 個(gè)配體(Jagged1、2 和Dll1、3、4)，γ-促分泌酶復(fù)合體DAPT 酶切釋放Notch 受體的活化形式NICD 和HES1。有研究表明Notch 通路在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，vSMCs)的增生/凋亡以及細(xì)胞表型變化過程中起到重要作用［4］。但Notch 信號在靜脈橋狹窄中的作用目前尚不清楚，本研究探討Notch 信號在靜脈橋狹窄中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c分組

SPA 級SD 大鼠，體質(zhì)量220～240 g，雌雄不限。共30 只(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，隨機(jī)分為對照組(control)、實(shí)驗(yàn)組和安慰劑組，每組10 只。各組實(shí)驗(yàn)動物均建立靜脈橋移植模型，從尾靜脈注射4%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)+肝素(1.5 mg/kg)。麻醉誘導(dǎo)成功后，左頸部備皮并切開頸部皮膚，游離左側(cè)頸總動脈和頸外靜脈。在25 倍手術(shù)顯微鏡下，剪取長約1 cm 靜脈作為血管橋，用11-0 醫(yī)用無損傷線將動脈兩端分別與靜脈橋行端端吻合［5］。術(shù)畢依層縫合，關(guān)閉切口。術(shù)后置大鼠于室溫，自然清醒。術(shù)畢每日觸摸頸部，靜脈橋處可及震顫。對照組術(shù)后不做任何處理;實(shí)驗(yàn)組(DAPT 組)每只每日皮下注射DAPT 10 mg/kg;安慰劑組(DMSO 組)注射安慰劑二甲基亞砜(DMSO)10 mg/kg。術(shù)后3 組動物均常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所有試劑均來自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 標(biāo)本采集和處理

術(shù)后組動物常規(guī)飼養(yǎng)，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第7、14、21 及28 天隨機(jī)抽取3 組動物各2 只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切開，游離靜脈橋，清除靜脈壁外附著組織，阻斷兩端吻合處，向腔內(nèi)注入適量10%甲醛液，10 min 后切取移植靜脈橋進(jìn)行常規(guī)病理切片，HE 染色及PCNA 免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)動物均放血處死。

1.3 觀察指標(biāo)

術(shù)后28d 收集齊各組移植靜脈后觀察以下指標(biāo):在顯微鏡下，以內(nèi)彈力膜為界，測量10 mm 長靜脈橋中膜平均厚度;計(jì)算靜脈橋中膜平滑肌細(xì)胞系PCNA 染色陽性指數(shù)(PCNA 指數(shù)= PCNA 陽性細(xì)胞/視野下100 個(gè)細(xì)胞×100%);取移植血管，裂解細(xì)胞制成蛋白液后，行Western blot，分析Notch1 和HES1 的蛋白濃度變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Notch 信號蛋白在靜脈橋中呈高表達(dá)狀態(tài)

Notch1，HES1 蛋白在靜脈移植中呈高表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長，這些蛋白表達(dá)逐漸增加(圖1)。HES1 蛋白的表達(dá)與靜脈狹窄的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(圖2)。

圖1 WB 顯示相關(guān)蛋白表達(dá)變化Fig 1 WB data show the result of Notch1 and HES1

圖2 HES1 蛋白表達(dá)與移植靜脈中膜厚度相關(guān)性Fig 2 The expression of HES1 protein and intima thickness of vein graft

2.2 抑制Notch 信號能夠緩解靜脈橋狹窄

DAPT 能夠明顯抑制HES1 蛋白的表達(dá)(圖3)，而安慰劑組中DMSO 對Notch 信號通路無影響，所以HES1 蛋白表達(dá)無變化。圖4 顯示各組移植靜脈后靜脈管壁厚度的差異。圖5 顯示DAPT 組中層厚度比例明顯低于對照組和DMSO 組(P＜0.05)，PCNA 指數(shù)顯示DAPT 組明顯低于其他兩組(P＜0.05)(圖6)。

圖3 各組移植靜脈vSMCs 中HES1 蛋白表達(dá)Fig 3 The expression of HES1 protein in each group

圖4 各組移植靜脈HE 染色Fig 4 H＆E staining in each group

圖5 各組移植靜脈中膜厚度比變化Fig 5 The intima thickness of vein graft in each group

3 討論

靜脈是用于治療冠心病和外周動脈狹窄最常用的自體材料，但靜脈橋再狹窄一直是制約其遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵因素［6］。雖然靜脈橋狹窄的原因目前尚未完全明了，有研究表明靜脈橋發(fā)生狹窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌樣細(xì)胞增生且細(xì)胞表型發(fā)生變化，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)在血管壁內(nèi)堆積，從而形成移植橋血管管腔狹窄，導(dǎo)致閉塞［5］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)如果降低中膜平滑肌細(xì)胞的增殖能力，可以極大限度的緩解靜脈橋狹窄的程度。

圖6 各組移植靜脈PCNA 指數(shù)變化Fig 6 PCNA positive index of vein graft in each group

Notch 信號是一個(gè)相對保守的通路，其在血管系統(tǒng)的生理和病理反應(yīng)中均起到重要作用，特別是在調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增生方面起到重要作用［3，7］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)靜脈橋狹窄過程中，Notch 信號通路明顯活化，其蛋白成員均呈高表達(dá)狀態(tài)，且與靜脈橋狹窄程度呈正相關(guān)，這說明Notch 信號與靜脈橋狹窄存在一定的相關(guān)性。而通過DAPT 阻斷Notch 信號通路，不僅可以使Notch 信號通路的蛋白表達(dá)下降，而且可以明顯抑制肺動脈高壓的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示血管平滑肌細(xì)胞PCNA 陽性指數(shù)明顯降低，提示血管平滑肌細(xì)胞增生程度明顯被抑制，表明DAPT 能夠通過阻斷notch 通路，影響血管平滑肌細(xì)胞的增生，從而達(dá)到抑制靜脈橋內(nèi)膜增厚的目的［8］。

［1］Hillis LD，Smith PK，Anderson JL，et al.2011 ACCF/AHA Guideline for coronary artery bypass graft surgery:executive summary:a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines［J］.Circulation，2011，124:2610-2642.

［2］Serruys PW，Morice MC，Kappetein AP，et al.Percutaneous coronary intervention versus coronary-artery bypass grafting for severe coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2009，360:961-972.

［3］Kudo FA，Muto A，Maloney SP，et al.Venous identity is lost but arterial identity is not gained during vein graft adaptation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27:1562-1571.

［4］Chen Y，Zheng S，Qi D，et al.Inhibition of Notch signaling by a c-secretase inhibitor attenuates hepatic fibrosis in rats［J］.PloS One，2012，7:e46512

［5］Sun J，Zheng J，Ling KH，et al.Preventing intimal thickening of vein grafts in vein artery bypass using STAT-3 siRNA［J］.J Transl Med，2012，10:2-3.

［6］Bikdeli B，Hassantash SA，Pourabdollah M，et al.Histopathologic insight into saphenous vein bypassgraft disease［J］.Cardiology，2012，123:208-215.

［7］Muto A，Model L，Ziegler K，et al.Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation:insights into the neointimal algorithm and management strategies［J］.Circ J，2010，74:1501-1512.

［8］Lyon CA，Koutsouki E，Aguilera CM，et al.Inhibition of N-cadherin retards smooth muscle cell migration and intimal thickening via induction of apoptosis［J］.J Vasc Surg，2010，52:1301-1309.