HCV LNAzyme對(duì)病毒5'非編碼區(qū)基因調(diào)控的特異性抑制作用

鄧益斌，農(nóng)樂(lè)根，梁祚仁，張 梁，覃羽華，何 平

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣西百色533000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是單股正鏈RNA 病毒，含5'非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)區(qū)(C、E 區(qū))、非結(jié)構(gòu)區(qū)(NS 區(qū))、和3'非編碼區(qū)，其中，5'非編碼區(qū)是丙型肝炎病毒復(fù)制所必需的元件，是HCV 十分保守的序列之一，其內(nèi)源性核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)在病毒基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，是病毒基因組中唯一的一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)。因此，推測(cè)切割破壞該位點(diǎn)RNA 序列可能有效阻斷病毒的基因表達(dá)。鎖核酸核酶(LNAzyme)是在脫氧核酶的2 條結(jié)合臂上引入1 個(gè)或多個(gè)鎖核酸單體構(gòu)建而成的新型核酸酶，與其他核酸酶相比，具有更強(qiáng)的分子雜交能力、更高的酶切活性和切割效率［1-4］。因此，在前期研究基礎(chǔ)上［5-7］，進(jìn)一步針對(duì)HCV 5'非編碼區(qū)IRES 位點(diǎn)的AUG 起始密碼子設(shè)計(jì)合成LNAzyme，兩側(cè)臂長(zhǎng)約18～19 nt，環(huán)結(jié)構(gòu)由GGCTAGCTACAACGA 堿基組成，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.9706 細(xì)胞系，觀察其對(duì)病毒復(fù)制與表達(dá)的抑制作用，以期為抗HCV 治療尋找專(zhuān)一、高效的新型分子藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.9706 細(xì)胞是一種轉(zhuǎn)染有丙型肝炎病毒5'-NCR/C 基因并穩(wěn)定表達(dá)的HepG2 細(xì)胞，含熒光素酶基因(中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)空軍醫(yī)院劉光澤博士惠贈(zèng))，本室常規(guī)培養(yǎng)于含G418(380 ITI1)、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下5～6 d 傳代1 次;DMEM 培養(yǎng)基、G418 和Trizol RNA 提取試劑盒等(Gibco 公司);胎牛血清(杭州四季清公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);熒光定量PCR 檢測(cè)HCV RNA 試劑盒(深圳匹基公司);化學(xué)發(fā)光試劑盒(Bright-GloTM熒光素酶分析系統(tǒng))(Promega 公司)。

1.2 方法

1.2.1 核酶分子設(shè)計(jì)與合成:針對(duì)HCV 5'-NCR 區(qū)IRES 位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)以下幾段序列:1)脫氧核酶:5'-GACTGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTAGTGTC-3';2)硫代脫氧核酶:5'-GSASCSTSGSCTAGCGGCT AGCTACAACGACGAGTAGSTSGSTSCS-3'，即在DNAzyme 基礎(chǔ)上對(duì)5'端前5 個(gè)堿基及3'端前5 個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾，以上標(biāo)“S”表示;3)鎖核酸核酶:5'-GALCTLGCTAGCGGCTAGCTACAACGACGAGTALGT GTLC-3'，即在DNAzyme 的2 個(gè)結(jié)合臂堿基A 或T分別引入2 個(gè)LNA 單體，以上標(biāo)“L”表示;4)無(wú)關(guān)脫氧核酶:5'-TCCAGAGGAAGGGCTAGCTACAACG ATTGCATACAGC-3'。其中，GGCTAGCTACAACGA為脫氧核酶的催化活性序列，其2 側(cè)為靶位特異性識(shí)別序列。以上各序列經(jīng)BLAST 排除與人同源后由美國(guó)GENELINK 公司合成修飾。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:對(duì)照組包括空白對(duì)照組(blank control)、脂質(zhì)體對(duì)照組(lipo-control)和無(wú)關(guān)鎖核酸核酶對(duì)照組(U-LNAzyme control)。實(shí)驗(yàn)組包括脫氧核酶(DNAzyme)、硫代脫氧核酶組(SDNAzyme)和鎖核酸核組 (LNAzyme )。 將HepG22.9706 細(xì)胞按1 ×105個(gè)/mL 接種于16 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，共設(shè)定6 個(gè)組，每組各設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后吸取培養(yǎng)上清液(－20 ℃保存)，分別在各組每孔中1 次性加入含核酶量為10 μmol/L的DMEM 混合液1 mL，分別于24、48 和96 h 收集各孔培養(yǎng)上清液500 μL，保存于－20 ℃待測(cè)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 培養(yǎng)上清液HCV RNA 含量檢測(cè):采用熒光定量PCR 試劑盒法。1)在預(yù)先準(zhǔn)備好的1.5 mL滅菌離心管中加入RNA 酶抑制劑20 μL，然后分別加入待測(cè)液，陰、陽(yáng)性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，再加入裂解液100 μL，振蕩混勻。2)將上述混合液全部轉(zhuǎn)移至核酸提取柱中，開(kāi)啟負(fù)壓裝置，抽干液體，然后分別用洗滌液A 和B 液各500 μL，各洗滌1 次，抽干。3)關(guān)閉負(fù)壓裝置，將提取柱轉(zhuǎn)入2 mL 離心管中，15 000 r/min，離心1 min。4)將提取轉(zhuǎn)入新2 mL離心管中，加入50 μL 洗脫液，靜置1 min，10 000 r/min，離心1 min，取12.5 μL 洗脫液加樣，余下步驟和PCR 擴(kuò)增條件嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果采用計(jì)算對(duì)數(shù)平均值的方法獲得cDNA 平均拷貝數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白表達(dá)檢測(cè):分別于基因轉(zhuǎn)染后24、48 和96 h 終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)板平衡至室溫，向每孔中加入經(jīng)室溫平衡后的熒光素酶發(fā)光試劑100μL，輕輕搖勻2 min 以使細(xì)胞完全裂解，立即應(yīng)用VictorTMWallac 1420 多標(biāo)記檢測(cè)儀檢測(cè)1 s 發(fā)光強(qiáng)度，輸出值以CPS 表示。

1.2.5 熒光顯微鏡系統(tǒng)觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá):培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染96 h 后，用倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察綠色熒光的表達(dá)情況并拍照，每次觀察5 個(gè)不同視野，取均值，結(jié)果以表達(dá)率(%)表示(表達(dá)率=a/A ×100%，其中，A 為普通光下計(jì)數(shù)細(xì)胞得數(shù)，a 為熒光下相同視野計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞得數(shù))。

1.2.6 LNAzyme 對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè):采用MTT 比色法檢測(cè)LNAzyme 對(duì)細(xì)胞活性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LNAzyme 對(duì)HCV RNA 復(fù)制的抑制

加入藥物后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HCV RNA 的復(fù)制均顯示出較強(qiáng)的抑制作用(P＜0.05)，其中，LNAzyme組的抑制作用最強(qiáng)，平均抑制率為48.02%。與用藥前比較，HCV RNA 的復(fù)制量也明顯下降(P＜0.05)，96 h 后，LNAzyme 組的平均下降率達(dá)81.21%(表1)。

2.2 LNAzyme 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞熒光素酶基因表達(dá)的抑制

加入藥物后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞熒光素酶基因的表達(dá)均顯示出較強(qiáng)的抑制作用(P＜0.05)，其中，LNAzyme 組的抑制作用最強(qiáng)，平均抑制率為53.05%。與用藥前比較，HCV RNA 的表達(dá)量也明顯下降(P＜0.05)，96 h 后，LNAzyme 組的平均下降率達(dá)84.25%(表2)。

2.3 LNAzyme 對(duì)細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)抑制情況

轉(zhuǎn)染96 h 后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)，LNAzyme 組(25% ±16%)明顯少于DNAzyme (82% ±26%)、S-DNAzyme(76%±30%)和對(duì)照組(85% ±30%)(圖1)。

表1 LNAzyme 對(duì)HepG2.9706 細(xì)胞HCV RNA 復(fù)制的影響Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in hepG2.9706 cells(±s，×105 copies/mL，n=6)

表1 LNAzyme 對(duì)HepG2.9706 細(xì)胞HCV RNA 復(fù)制的影響Table 1 The inhibitory effect of LNAzyme on replication of HCV RNA in hepG2.9706 cells(±s，×105 copies/mL，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with DNAzyme group;#P＜0.05 compared with S-DNAzyme group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group0 hour24 hours48 hours96 hours blank control group1.52 ±0.441.55 ±0.471.61±0.521.65 ±0.44 lipo-control group1.62 ±0.451.58 ±0.461.67 ±0.441.65 ±0.43 U-LNAzyme control group1.55 ±0.451.57 ±0.431.62 ±0.481.68 ±0.42 DNAzyme group1.65 ±0.581.23 ±0.491.02 ±0.550.83 ±0.53 S-DNAzyme group1.62 ±0.481.02 ±0.530.81 ±0.580.75 ±0.42 LNAzyme group1.65 ±0.440.83 ±0.310.50 ±0.220.31 ±0.15＊△#▲

表2 LNAzyme 對(duì)HepG2.9706 細(xì)胞熒光素酶基因表達(dá)的影響Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in hepG2.9706 cells(±s，×104 CPS，n=6)

表2 LNAzyme 對(duì)HepG2.9706 細(xì)胞熒光素酶基因表達(dá)的影響Table 2 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase in hepG2.9706 cells(±s，×104 CPS，n=6)

＊P＜0.05 compared with control groups;△P＜0.05 compared with DNAzyme group;#P＜0.05 compared with S-DNAzyme group;▲P＜0.05 compared with before transfection.

group0 hour24 hours48 hours96 hours blank control group4.97 ±2.924.95 ±2.894.96±2.814.97 ±2.79 lipo-control group4.89 ±2.914.91 ±2.854.89 ±2.754.91 ±2.87 U-LNAzyme control group4.93 ±2.884.89 ±2.784.91 ±2.834.89 ±2.78 DNAzyme group4.87 ±2.663.57 ±2.663.02 ±2.692.41 ±2.44 S-DNAzyme group4.91 ±2.873.04 ±2.612.44 ±2.152.21 ±1.88 LNAzyme group4.89 ±2.452.01 ±1.521.65 ±1.230.77 ±0.25＊△#▲

圖1 LNAzyme 對(duì)細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)的抑制作用Fig 1 The inhibitory effect of LNAzyme on expression of luciferase(×100)

2.4 LNAzyme 對(duì)細(xì)胞活性的影響

用藥前和用藥后24h、48h 和96 h，LNAzyme 組的MTT 比色A 值分別為1.22 ±0.05、1.18 ±0.04、1.24 ±0.05 和1.15 ±0.04，與空白對(duì)照組的1.37 ±0.04 均無(wú)差異，表明鎖核酸脂質(zhì)體混合物對(duì)細(xì)胞活性基本無(wú)影響。

3 討論

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是單股正鏈RNA 病毒，屬黃病毒屬。HCV 基因組RNA 由約9400 核苷酸(nt)組成，含5'非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)區(qū)(C、E區(qū))、非結(jié)構(gòu)區(qū)(NS 區(qū))、和3'非編碼區(qū)，其中，5'非編碼區(qū)是丙型肝炎病毒復(fù)制所必需的元件，其內(nèi)源性核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)是病毒基因組中唯一的一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)，在病毒基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。雖然HCV 有多種基因型，各型間的基因序列有差異，但在IRES 位點(diǎn)AUG 起始密碼子上下游約20nt 的序列，在各型HCV間卻是十分保守的。因此，推測(cè)切割破壞該位點(diǎn)RNA 序列可能特異性抑制病毒基因的復(fù)制與表達(dá)。

本研究針對(duì)丙型肝炎病毒5'非編碼區(qū)IRES 位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成LNAzyme，并以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.9706 細(xì)胞，采用分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HCV RNA 含量及熒光素酶基因表達(dá)情況，觀察鎖核酸核酶對(duì)病毒基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，DNAzyme、S-DNAzyme 和LNAzyme 對(duì)丙型肝炎病毒RNA 復(fù)制及熒光素酶基因的表達(dá)均有較強(qiáng)的抑制作用，其中，LNAzyme 的抑制作用最強(qiáng)，且隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用呈增高趨勢(shì)。此外，MTT比色結(jié)果表明，LNAzyme 脂質(zhì)體混合物對(duì)細(xì)胞活性基本無(wú)影響?？傊槍?duì)HCV 5'非編碼區(qū)IRES 位點(diǎn)的鎖核酸核酶，體外能特異性抑制病毒基因調(diào)控，為抗丙型肝炎病毒基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望成為RNA 病毒基因治療的新型反義核酸藥物。

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