動物抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合的結(jié)構(gòu)模擬

黃德滿,尹哲進,文成規(guī),尹學峰,王澤港

(1.金日成綜合大學生命科學學院，平壤 99903；2.揚州大學生物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009)

褐藻糖膠(fucoidan,FUC)是一類主要由巖藻糖及硫酸酯基團組成的多糖類物質(zhì),廣泛存在于褐藻及一些海洋無脊椎動物(如海參,海膽等)體內(nèi)[1]。 含有豐富的免疫調(diào)節(jié)成分，具有類似于肝素的多糖結(jié)構(gòu)，有較好的抗凝血活性，雖然其活性低于肝素，但由于肝素的副作用較大，因而仍具有較好的應(yīng)用前景。

過去幾十年間FUC得到了較為廣泛、系統(tǒng)的研究,己證實其具有多種生理活性,包括抗凝血與抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血脂、抗氧化、抗補體特性、抗炎，還具有尿道、腎病、胃保護作用等[2-6]。但基于其結(jié)構(gòu)信息的構(gòu)效關(guān)系研究卻相對較少。

隨著生物信息學和結(jié)構(gòu)生物學的發(fā)展，越來越多的受體生物大分子的三維結(jié)構(gòu)被測定，可以用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法設(shè)計新的先導(dǎo)化合物[7-9]。

本試驗應(yīng)用生物信息學的方法，研究分析了動物抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)變化特征。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

數(shù)據(jù)庫：PIR(蛋白質(zhì)功能預(yù)測數(shù)據(jù)庫，http://pir.georgetown.edu/)，PDB(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，http://www.rcsb.org/pdb/)、CHARMM(Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics)的 PAR22(http://www.charmm.org/)。

軟件：多序列比對軟件 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalW),分子模擬軟件ChemOffice Ultra7.0,HyperChem 7.03,VMD1.82，生物大分子分子動力學并行計算軟件 Hyangsan[10]。

1.2 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)仿真系統(tǒng)的構(gòu)建

利用HyperChem7.03，以抗凝血酶Ⅲ分子(從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB中獲得編號為1ANT的蛋白結(jié)構(gòu))為模型，模擬褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)模型。為了提供與生物體內(nèi)相似的水環(huán)境，用VMD1.82中的TIP3模型，生成水分子。

2 結(jié)果與分析

2.1 搜索抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點

褐藻糖膠與肝素在化學結(jié)構(gòu)和功能上具有相似的特征，二者具有相同的抗凝血酶Ⅲ結(jié)合位點。在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(PIR)中，以抗凝血酶Ⅲ的蛋白序列為搜索序列，用 “BLAST”程序進行數(shù)據(jù)庫搜索，獲得相似性較高的抗凝血酶Ⅲ的蛋白質(zhì)序列，用于進一步分析抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點。

用大分子結(jié)構(gòu)搜索程序Vast， 以抗凝血酶Ⅲ 1ANT(PDB序列號)為標準序列來搜索結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB的同源序列，獲得高度同源序列1TB61、1ANTI、1ATH2、1ANTL、2ANTI、I59611、1ATTA、P41361、1ATT2、Q7M364。應(yīng)用多序列比對軟件CLUSTALW對這些同源蛋白質(zhì)序列進行多重序列比對。多序列比對結(jié)果顯示，Arg13、Asn45、Arg46、Arg47、Glu113、Lys114、Lys125和Arg129是高度保守的肝素結(jié)合位點。

2.2 抗凝血酶Ⅲ與褐藻糖膠結(jié)合后抗凝血酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)變化

觀察模擬過程中抗凝血酶Ⅲ—褐藻糖膠結(jié)構(gòu)的變化，其結(jié)構(gòu)變化時間持續(xù)了3.5 ns(圖1)。如圖1所示，2.2 ns后振動狀態(tài)變成相對穩(wěn)定的狀態(tài)，而在抗凝血酶Ⅲ(不結(jié)合褐藻糖膠)的分子動力學模擬實驗中，120 ps后觀察到穩(wěn)定狀態(tài)，所用的時間是結(jié)合褐藻糖膠時所用時間的百分之二。比較抗凝血酶Ⅲ與抗凝血酶Ⅲ—褐藻糖膠復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)中心環(huán)(RCL)的變化最明顯(圖2)。

這表明抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠相結(jié)合后，抗凝血酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，即外源分子的結(jié)合會改變抗凝血酶Ⅲ的三維構(gòu)象。具體表現(xiàn)為結(jié)合后RCL更加外露，易于與其它反應(yīng)分子結(jié)合，從而增強抗凝血酶Ⅲ的反應(yīng)活性。

圖1 抗凝血酶Ⅲ與褐藻糖膠結(jié)合后抗凝血酶Ⅲ的均方根偏差(RMSD)的變化Fig.1 The RMSD change of antithromin Ⅲ combined with fucoidan

注：A代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合初期狀態(tài)；B代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合平衡狀態(tài)圖2 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時RCL的結(jié)構(gòu)變化Fig.2 The RCL change of antithrombin Ⅲ combined with fucoidan

2.3 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合位點殘基的變化

褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合的時候，Lys28、Lys29、Ala43、Thr44，Ala383和Arg393的均方根偏差(RMSD)在0.150 nm以上(表1)。

表1 褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合時均方根偏差最高的殘基均方根偏差(RMSD)Table 1 The residues having great RMSD when fucoidan is bound to antithrombin Ⅲ

抗凝血酶Ⅲ中的Lys28、Lys29、Ala43、Thr44在褐藻糖膠的結(jié)合位點周圍,并且Lys28、Lys29、Ala43和Thr44周圍的褐藻糖膠的結(jié)合位點具有較高的RMSD值。Ala383和Arg393分別是抗凝血酶Ⅲ和凝血酶的結(jié)合位點，也就是形成RCL的殘基。這些殘基結(jié)合活性的增強是抗凝血酶Ⅲ與配體之間結(jié)合后產(chǎn)生的結(jié)果。

褐藻糖膠結(jié)合位點的8個殘基中有4個殘基(Arg13、 Arg46、Arg47、Glu113)的RMSD較平均RMSD(0.049 nm)高，而另外4個殘基比平均RMSD的值低(表2)。

表2 抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點殘基的均方根偏差(RMSD)Table 2 RMSD of the residues at the binding site of antithrombin Ⅲ to heparin

注：A代表抗凝血酶; B代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合;C代表抗凝血酶Ⅲ和肝素結(jié)合圖3 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時Arg393的位置變化Fig.3 The various states of Arg393 in some sorts of antithrombin Ⅲ combined with fucoidan

這表明，抗凝血酶Ⅲ中的褐藻糖膠的結(jié)合位點是相對固定的。但是當褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，引起靠近褐藻糖膠的殘基的均方根偏差(RMSD)增高，并導(dǎo)致Lys28與Thr44之間的部分出現(xiàn)了較大的變化。無論褐藻糖膠結(jié)合與否，凝血酶Ⅲ內(nèi)RCL部分,Ala383和Arg393的RMSD比較高，與其它部分相比具有較高的結(jié)合活性。另一方面，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物的所有原子的平均RMSD是0.208 nm,其中RCL中的Cα原子的平均RMSD是0.074 nm，這表明除Cα外其它原子的空間位置變化都很大。模擬結(jié)果表明，抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時Arg393從抗凝血酶Ⅲ的內(nèi)部激發(fā)到了復(fù)合物結(jié)構(gòu)的表面(圖3)。當被褐藻糖膠激活的抗凝血酶Ⅲ和凝血酶結(jié)合時，抗凝血酶Ⅲ的Arg393與凝血酶的活性中心殘基Asp、His、Ser結(jié)合，并進入到四面體的過渡狀態(tài)。

抗凝血酶Ⅲ和凝血酶的復(fù)合物與抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的復(fù)合物進行比較，Cα原子的平均RMSD值是0.024 nm,RCL的RMSD 平均值是0.017 nm，二者比較接近。這表明，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是有利于結(jié)合凝血酶的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 語

計算機輔助藥物設(shè)計方法,在新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化中起重要的作用。理論計算和計算機輔助藥物設(shè)計方法可以研究生物大分子上藥物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),配體與受體復(fù)合物的構(gòu)型與立體化學特征,結(jié)合模式和選擇性等等,可為改進現(xiàn)有的生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu),設(shè)計新的化合物,提供理論上的指導(dǎo)和思路[11-12]。

褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合的時候，反應(yīng)中心環(huán)(RCL)的變化最明顯，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ的結(jié)合使抗凝血酶Ⅲ從非活性狀態(tài)變?yōu)榱嘶钚誀顟B(tài)，從而更容易與凝血酶結(jié)合。

本試驗通過生物信息學方法，分析了褐藻糖膠與抗凝血酶Ⅲ的作用機制，研究結(jié)果為開發(fā)新藥提供了有重要參考價值的理論依據(jù)。

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