不同季節(jié)竹葉提取物對致病性大腸桿菌抑菌效果的研究

金蘭梅，伍清林，喬楠楠，楊 彪，董宏亮，宋二寶

(金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038)

竹葉在我國有悠久的利用歷史，是一味傳統(tǒng)的清熱解毒藥。近幾年的研究表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖及其他有效成分，如酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內(nèi)酯、特種氨基酸和活性肽、錳、鋅、硒等物質(zhì)。竹葉黃酮具有抗衰老、抗應(yīng)激、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、阻斷亞硝化反應(yīng)、增強(qiáng)免疫能力、抗菌和抑菌等作用[1]。有關(guān)竹葉提取物的抑菌作用已有不少研究報(bào)道，劉曉蓉等[2]研究了淡竹葉提取物的抑菌性能，結(jié)果表明，提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為6.2%， 對溶血性鏈球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度都是12.5%; 耐熱性好; 抑菌pH值范圍在4～9之間; 具有良好的防腐保鮮效果。鄧騖遠(yuǎn)等[3]采用濾紙片法，測定毛竹葉與慈竹葉的抑菌作用，得知毛竹葉對枯草芽孢桿菌的抑制作用強(qiáng)，慈竹葉對大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)，慈竹葉的抑菌效力強(qiáng)于毛竹葉。袁國強(qiáng)等[4]利用有機(jī)溶劑為提取介質(zhì)獲得竹葉提取液，對食源性細(xì)菌的生長有較好的抑制作用。賈桂云等[5]應(yīng)用金鑲玉竹葉的乙醇冰醋酸提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，最小抑菌濃度是3.8%，提取物的pH值影響抑菌效果，在酸性、中性條件下抑菌作用比堿性條件強(qiáng)。金蘭梅等[6]應(yīng)用竹葉水提物對引起畜禽疾病的主要致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌圈在14～19 mm之間，MIC在1.56～6.25 mg·mL-1之間，MBC在3.125～12.5 mg·mL-1之間。竹葉水提物對金黃色葡萄球菌抑菌活性強(qiáng)于對大腸桿菌的抑菌活性。眾多試驗(yàn)證明，竹葉提取物對細(xì)菌有明顯的抑制作用。

近年來，在畜禽生產(chǎn)中和獸醫(yī)臨床上大量使用抗生素，動物性產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，且呈日趨嚴(yán)重的態(tài)勢。一方面對消費(fèi)者構(gòu)成危害，威脅人民身體健康；另一方面對動物性產(chǎn)品的正常出口貿(mào)易造成極大障礙。所以國家對一些抗生素和生長促進(jìn)劑在動物生產(chǎn)中禁止使用，而把尋找無(低)藥殘、無(低)污染、能替代抗生素的促生長物質(zhì)的研究作為重點(diǎn)[7]。因此，本試驗(yàn)采集南京幕府山周圍春夏秋冬四季的孝順竹竹葉，用水提法提取有效成分，并從患乳房炎奶牛的乳汁中和患大腸桿菌的病豬體內(nèi)分離出致病性強(qiáng)對抗生素耐藥的大腸桿菌，對其進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較各季節(jié)竹葉的抑菌效果。為在獸醫(yī)臨床上防治細(xì)菌性疾病，充分利用當(dāng)?shù)刭Y源和進(jìn)一步研制抑菌中草藥產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來源 竹葉：采集金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)校園內(nèi)孝順竹，分別在2012年12月(冬季)、2013年3月(春季)、6月(夏季)、9月(秋季)、每月均在15日14:00-16:00采集。分別選取竹冠上、中、下部健康和已完成展葉的葉片，然后將采集的葉片均勻混合，并用自來水沖洗干凈，放在通風(fēng)處陰干3 d，后放入60 ℃的恒溫箱內(nèi)烘干，粉碎干燥保存。

致病菌性大腸桿菌：豬源從于南京地區(qū)某規(guī)模化豬場的患大腸桿菌病死豬的內(nèi)臟分離獲得，牛源從某規(guī)?；膛龌既榉垦啄膛Ｈ橹蟹蛛x獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑、藥敏紙片 營養(yǎng)瓊脂(NA)、麥康凱瓊脂(MAC)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20120115、20120525；營養(yǎng)肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三塘鐵瓊脂(TSI)，腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15e、靛基質(zhì)試劑、頭孢噻肟(CTX)等16種抗生素藥敏紙片均購于杭州天和微生物試劑有限公司。質(zhì)控菌大腸埃希氏菌ATCC259購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司03091BA)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠2080850)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠DNS-9052BS-III)、立式壓力蒸汽滅菌箱(YXG-LS-75SIDI)、恒溫?fù)u床(KYCC-100)、H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)A01002923)、XA-1 型粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠)、顯微鏡等及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.1.4 試驗(yàn)動物 普通級小白鼠，雌雄不限，體重在20～22 g之間，購于南京盛民科研實(shí)驗(yàn)動物場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病性大腸桿菌準(zhǔn)備 1) 大腸桿菌分離鑒定。豬源大腸桿菌分離：剖檢病豬，無菌采集心臟、肝臟和脾等病變組織涂于MAC培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。牛源大腸桿菌分離：無菌采集患乳房炎奶牛的乳汁涂于MAC培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

分別取MAC培養(yǎng)基上典型紅色菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢，初步區(qū)分革蘭氏陽性和陰性，然后做腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定，并轉(zhuǎn)接種于CTX和TSI培養(yǎng)基，觀察反應(yīng)結(jié)果，確認(rèn)大腸桿菌。

2) 致病性試驗(yàn)。將生化反應(yīng)已鑒定為大腸桿菌的菌株接種于普通肉湯， 37 ℃培養(yǎng)18 h。經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)用生理鹽水稀釋成1.0×107CFU/mL的菌液，0.5 mL·只-1分別腹腔注射小白鼠，每株做3個重復(fù)。對照組小白鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL·只-1。觀察小白鼠的活動及發(fā)病死亡情況，對發(fā)病死亡小白鼠立即進(jìn)行剖檢，觀察病變，取其寎料涂片、染色、鏡檢，并接種于MAC培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。未發(fā)病的繼續(xù)觀察至1周。

3) 抗生素藥敏試驗(yàn)與耐藥菌株的篩選。采用WHO 推薦的Kirby-Bauer法，取頭孢噻肟(CTX)等16種常用的抗生素藥敏紙片對致病性強(qiáng)的大腸桿菌(豬源、牛源各10株)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。依據(jù)NCCLS有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，每次測定均以質(zhì)控菌為對照，只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結(jié)果才有效。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)M100-S15[8]和文獻(xiàn)[9]，以敏感、中介、耐藥3種形式對抑菌圈大小作出判定。

挑取對16種抗生素耐藥達(dá)8種以上的菌株，將其接種于5 mL LB培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，再用LB溶液將細(xì)菌懸液稀釋至1.0×107CFU/mL，4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2 竹葉有效成分提取 采用水提法，分別稱取不同季節(jié)的干燥竹葉各50 g，加入10倍量水浸泡1.5 h，裝入圓底燒瓶中，放在恒溫電熱套上煎煮，第一次煎以沸騰開始計(jì)算100 ℃煎煮50 min，用8層紗布過濾，濾渣再加100 mL水，第二次煎以70 ℃煎煮30 min。合并兩次濾液，濃縮至50 mL，得濃縮的濃度為1 g·mL-1，調(diào)整pH值至7.0～7.2。分別裝瓶，備用。

將竹葉的提取液加入無水乙醇至醇含量達(dá)到70%(乙醇/混合液=70%)，4 ℃靜置24 h，1 500 r·min-1離心5 min后紗布過濾，所剩溶液加蒸餾水定容至相當(dāng)于生藥1 g·mL-1。灌注封瓶后流通蒸汽消毒滅菌30 min，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 竹葉提取物對大腸桿菌藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂打洞法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將待檢菌液吸取50 uL注入NA培養(yǎng)基中，用玻璃棒充分涂抹均勻，然后用外徑為6 mm 的打孔器在培養(yǎng)基上等距離打孔，吸取融化的營養(yǎng)瓊脂液補(bǔ)底。每孔加1 g·mL-1竹葉的提取液50 uL，在4 ℃冰箱內(nèi)放置30 min 1 h，然后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑。 每個樣本做3個重復(fù)，以3次平均值為抑菌圈直徑。抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，≤10 mm為低敏[6]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用試管二倍稀釋法[6]，取滅菌試管11支，每管先加入無菌肉湯1 mL，然后第一管中加入滅菌的受試竹葉提取物1 mL，混勻后取出1 mL放入第2管中，依次類推。直到第9管取出1 mL棄去，配成含竹葉提取物分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等各種濃度的液體。第10管不加藥物作為對照，以便觀察培養(yǎng)基是否適合于細(xì)菌生長。第11管加受試竹葉提取物1 mL，混勻取出1 mL棄去，不接種細(xì)菌，以便觀察受試中藥是否受污染。

取0.05 mL菌液分別加入上述1～10管中，混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。若肉湯混濁，表示細(xì)菌生長;若肉湯完全清亮，表示無細(xì)菌生長。觀察無菌生長管所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

吸取0.1 mL培養(yǎng)物，移種于不含藥的普通營養(yǎng)瓊脂上，涂抹均勻，置37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察有無細(xì)菌生長，以無細(xì)菌生長的藥物最低濃度作為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素藥敏試驗(yàn)與耐藥菌株的篩選

選擇致病性強(qiáng)的豬源和牛源的大腸桿菌各10株，應(yīng)用頭孢噻肟(CTX)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(CN)、強(qiáng)力霉素(DO)、阿米卡星(AK)、環(huán)丙沙星(CIP)、氟羅沙星(FO)、左氟沙星(LEV)、恩諾沙星(ENR)、洛美沙星(LOM)、四環(huán)素(TE)、氨芐西林(APM)、復(fù)方新諾明(SXT)等16種抗生素藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果得知，20株大腸桿菌對抗生素均有不同程度的耐藥，最高的為13耐，最低的為5耐。其中豬源9號菌株耐13種抗生素，2號、4號、7號菌株分別為9耐和11耐；牛源12號、14號、15號、20號菌株均為11耐(表1)。

表1 抗生素對大腸桿菌藥敏試驗(yàn)分析Table 1 The test results of antibiotic drug susceptibility to Escherichia coli

2.2 竹葉提取物藥敏試驗(yàn)

選擇對9種以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的菌株(2、4、7、9、12、12、14、15、20號菌株)進(jìn)行竹葉提取物的藥敏試驗(yàn)。

由表2可知，竹葉提取物對抗生素耐藥的大腸桿菌有較明顯的抑制作用。結(jié)合表1可以看出，大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥，對竹葉提取物依然敏感。不同季節(jié)采集的竹葉提取物對不同源不同株的大腸桿菌抑菌效果不同，對同源不同株的大腸桿菌抑菌效果也不同。冬季采集的竹葉提取物抑菌效果最佳，對受試菌株均在高敏以上，其中7、15和9號菌株對CTX 等16種抗生素表現(xiàn)11耐和13耐，對冬季竹葉提取液極敏；秋季抑菌效果相對較差，抑菌圈在低敏和中敏之間。一年四季抑菌效果比較是冬季>春季>夏季>秋季。說明不同季節(jié)采集的樣品抑菌效果不同。

2.3 竹葉提取物最小抑菌濃度(MIC)

不同季節(jié)采集的竹葉提取物對8株大腸桿菌均有不同程度的抑制作用。其中春、夏季采集的竹葉提取物對豬源、牛源大腸桿菌的MIC均在3.125～6.250 mg·mL-1之間，秋季MIC在6.25～12.50 mg·mL-1之間，冬季的MIC在1.560～3.125 mg·mL-1之間。說明冬季竹葉提取物對大腸桿菌的抑制作用較好，秋季較差(表3)。

表2 不同季節(jié)竹葉提取物對大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)分析Table 2 The test results of the susceptibility of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mm

表3 不同季節(jié)竹葉提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)Table 3 The minimum inhibitory concentration of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mg·mL-1

2.4 竹葉提取物最小殺菌濃度(MBC)

由表5可知，不同季節(jié)采集的竹葉提取物對不同株的細(xì)菌均有不同程度的殺滅作用。春、夏季竹葉提取物對大腸桿菌的MBC均6.25～12.50 mg·mL-1之間，秋季MBC在12.5～25 mg·mL-1之間，冬季的在3.125～6.250 mg·mL-1之間。最小殺菌濃度均高于最小抑菌濃度的1個濃度梯度。說明不同季節(jié)采集的竹葉提取物抑菌效果較為穩(wěn)定。

表4 不同季節(jié)竹葉提取物對大腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Table 4 The minimum bactericidal concentration of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mg·mL-1

3 結(jié)論與討論

1) 本試驗(yàn)通過常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，從病豬心、肝等組織和患乳房炎奶牛的乳汁中分離得到大腸桿菌，通過抗生素藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20株大腸桿菌對16種抗生素均有不同程度的耐藥，最高的13耐，最低的5耐。采用中藥傳統(tǒng)的煎煮方法提取竹葉中的有效成分，然后應(yīng)用竹葉提取物對抗生素耐藥的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果說明，大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥，對竹葉提取物依然敏感。試驗(yàn)同時證明，竹葉提取物藥敏試驗(yàn)、最小抑菌濃度與最小殺菌濃度反應(yīng)的結(jié)果是一致的，不同源的大腸桿菌菌株對不同季節(jié)采集的竹葉提取液有著不同程度的敏感性。

2) 據(jù)報(bào)道[10-12]竹葉中含有黃酮類化合物和生物活性成分,隨竹種、季節(jié)的變化而變化。本次試驗(yàn)在研究竹葉抑菌效果的基礎(chǔ)上比較不同季節(jié)其提取物抑菌效果的差異.由表2、表3、表4可知，不同季節(jié)采集的竹葉提取物對不同源的大腸桿菌抑菌效果不同，春季抑菌圈在15～17 mm之間，MIC在3.125～6.250 mg·mL-1之間，MBC在6.25～12.50 mg·mL-1之間；夏季抑菌圈在13～15 mm之間；MIC在3.125～6.250 mg·mL-1之間，MBC在6.25～12.50 mg·mL-1之間；秋季抑菌圈在9～12 mm之間；MIC在6.25～12.50 mg·mL-1之間，MBC在12.5～25.0 mg·mL-1；冬季抑菌圈在15～20 mm之間，MIC在1.560～3.125 mg·mL-1之間，MBC在3.125～6.250 mg·mL-1。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了抑菌作用強(qiáng)弱與竹葉中含黃酮類化合物和生物活性成分隨竹種、季節(jié)的變化有關(guān)。本試驗(yàn)采用的竹種是孝順竹，采用定點(diǎn)、定株、定時采樣，不同季節(jié)抑菌效果強(qiáng)弱，順序?yàn)槎?春季>夏季>秋季。其他種類竹葉抑菌效果、季節(jié)的變化的強(qiáng)弱有待于進(jìn)一步研究。

3) 竹子的化學(xué)組成中不含有毒物質(zhì)，符合食品對原料和添加劑化學(xué)成分的嚴(yán)格要求，2002年國家衛(wèi)生部已將 “淡竹葉”列入既是食品又是藥品的保健食品原料名單[13]。因此開發(fā)竹葉作為畜禽飼料添加劑，既可以防治大腸桿菌病，又不會引起畜禽中毒，更重要的是減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，減少畜禽體內(nèi)抗生素的殘留，為人類提供綠色畜產(chǎn)品，保障人類身體健康。畜禽養(yǎng)殖戶也可以利用當(dāng)?shù)氐馁Y源在適當(dāng)時機(jī)采集竹葉煎煮后讓其動物自由飲用，預(yù)防大腸桿菌病的發(fā)生。

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