周貽兵,林野,李磊,王婭芳,劉利亞
(貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴州貴陽550004)
高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量
周貽兵,林野,李磊,王婭芳,劉利亞*
(貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴州貴陽550004)
采用高效液相色譜熒光法測定牛奶中的黃曲霉毒素M1。牛奶中的黃曲霉毒素M1用乙腈超聲提取,離心,上清液濃縮后用50mLPBS緩沖液稀釋,過免疫親和層析柱凈化,10%甲醇水溶液10mL淋洗柱,2m L甲醇洗脫,洗脫液氮吹干后,用10%乙腈水溶液1mL蝸旋溶解殘渣,過0.22μm濾膜,上機(jī)測定。對加入乙腈比例、淋洗液及洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明:m牛奶:V乙腈=1:2有效的沉淀蛋白避免了過柱堵塞問題,提高了過柱效率。用10%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱,能有效的去除掉雜質(zhì),避免了洗脫液成渾濁現(xiàn)象。該方法的線性范圍寬,回收率為89.1%~93.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%~9.7%之間,檢出限為0.01μg/kg,低于1/10現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn),符合檢測要求,適用于對牛奶中黃曲霉素素M1的檢測。
黃曲霉毒素M1;牛奶;免疫親和層析柱;高效液相色譜法
黃曲霉毒素M1于1993年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物,是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì),主要表現(xiàn)在致癌、致畸、致突變。黃曲霉毒素M1是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后,在體內(nèi)的肝微粒體單氧化酶系催化下,被羥基化生成的二次毒性代謝產(chǎn)物,存在于動物分泌的乳汁和產(chǎn)生尿液中。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素M1污染的食品之一,對牛奶中黃曲霉毒素M1準(zhǔn)確定量,了解真實污染水平,對維護(hù)人群健康具有重要意義。測定黃曲霉毒素M1的方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫法和薄層色譜法等[1-6]。其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性好,檢出限低等優(yōu)點(diǎn),但儀器價格昂貴,不易在基層實驗室普及,熒光光度法準(zhǔn)確性差,是一種半定量方法,難以普及,酶聯(lián)免疫法為初篩法,易出現(xiàn)假陽性,薄層色譜法所需設(shè)備簡單,但操作繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn),而高效液相色譜熒光法具有操作簡單、靈敏度高,穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),得到廣泛的應(yīng)用。按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉M1的測定》中液體奶處理方法,過柱凈化過程中易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象,在洗脫過程中,洗脫液渾濁,酸奶pH通常低于免疫親和柱的使用范圍,影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文選擇乙腈為提取劑,有效沉淀蛋白且提取黃曲霉毒素M1更加充分,經(jīng)離心后得到澄清的提取液,濃縮后用PBS緩沖液稀釋后過柱,避免了pH對測定結(jié)果的影響,大大提高了過柱效率。
1.1 儀器與材料
Waters2695型高效液相色譜儀,配Waters2475熒光檢測器,LABOROTA 4001標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,臺式高速冷凍離心機(jī):SiGma公司;TTL-DCⅡ型氮吹儀,超純水機(jī):艾科浦;黃曲霉毒素M1免疫親和柱:北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。
黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品(0.5μg/mL,PrbioLab公司),水為超純水,乙腈(色譜純)。
PBS緩沖液:稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于900mL超純水中,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4,最后加水定容至1 L即可。
1.2 樣品的提取與凈化
1.2.1 樣品的提取
準(zhǔn)確稱取10.00 g牛奶于50mL離心管中,加入20mL乙腈,超聲提取10min,1 0000 r/min離心,取出全部上清液于50mL濃縮瓶中,濃縮使?jié)饪s液體積小于2mL,加入50mLPBS緩沖液搖勻,待凈化。
1.2.2 凈化
將上述全部溶液過黃曲霉毒素M1免疫親和柱,用10%甲醇水溶液10mL淋洗,棄去全部流出液,用2mL甲醇洗脫免疫親和柱,收集全部洗脫液于5mL玻璃試管中,在40℃下氮吹干,用V乙腈∶V水=10∶90的溶液溶解殘留物,過0.22μm的濾膜,上機(jī)測定。
1.3 液相色譜條件
色譜柱:Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm× 5μm);流動相為25%乙腈水溶液,流速1.0mL/min,激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長:435 nm,進(jìn)樣體積10μL。
2.1 工作曲線與檢出限
將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成1.0、5.0、 10.0、20.0、40.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在1.3色譜條件下進(jìn)行分析,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,黃曲霉毒素M1的線性回歸方程為Y=30 900X+75 400(R2=0.999 9),以3 S/N計算方法的檢出限為0.01μg/kg,低于現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn),符合檢測要求。
2.2 加標(biāo)回收率及精密度
向空白牛奶樣品中加兩個濃度水平的黃曲霉毒素M1,每個添加量做6次平行樣,方法的平均回收率在89.1%~93.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%~9.7%之間(見表1)。
表1 方法的加標(biāo)回收率及精密度Table1 The recovery and precision of the method
3.1 提取條件的優(yōu)化
乙腈具有沉淀蛋白的作用,本實驗考察了m牛奶∶V乙腈=1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 g/mL時蛋白的沉淀效果。實驗發(fā)現(xiàn),乙腈比例越高,蛋白的沉淀效果越好,當(dāng)乙腈與牛奶的比例達(dá)到2以上時,牛奶中的蛋白基本沉淀完全,離心后得到比較澄清的溶液。同時比較了不同乙腈比例對陽性牛奶樣品中黃曲霉毒素M1提取效率見表2。
表2 不同乙腈比例對陽性牛奶樣品中黃曲霉毒素M1測定結(jié)果比較Table2 Comparision of determination result of positive sample extracted by different acetonitrile proportion
表2表明,隨著乙腈加入量的增加,牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的提取效率逐漸增加,m牛奶∶V乙腈=1∶0時,即為國標(biāo)GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉M1的測定》的提取方法,測定結(jié)果偏低,當(dāng)m牛奶∶V乙腈= 1∶2,、1∶3、1∶4時,黃曲霉毒素M1的測定結(jié)果非常接近,當(dāng)乙腈的比例增加時,從而增加了濃縮的時間和處理成本,所以本實驗選擇m牛奶∶V乙腈=1∶2提取牛奶中的黃曲霉毒素M1。
3.2 淋洗液的選擇
提取液過免疫親和柱后,用10mL純水沖洗免疫親和柱,用乙腈或甲醇洗脫后,洗脫液呈乳白色,為了解決此問題,本實驗考察了體積比為5%、10%、15%、20%甲醇水溶液10mL淋洗免疫親和柱。實驗結(jié)果表明:隨著甲醇比例的逐漸增大,洗脫液逐漸變澄清,當(dāng)甲醇比例達(dá)到10%,用乙腈洗脫后溶液基本澄清,但隨著甲醇比例的增大,黃曲霉毒素M1的回收率逐漸降低,綜合考慮本實驗確定淋洗液的比例為10%甲醇水溶液。
3.3 洗脫液的優(yōu)化
將含有25 ng的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液加到免疫親和柱上,過柱后,用10mL 10%甲醇水溶液洗脫雜質(zhì),分別用1mL~4mL 80%甲醇水溶液、甲醇、乙腈進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,40℃氮吹干,用10%乙腈水溶液1mL溶解殘渣,蝸旋混均,過0.22μm濾膜,上機(jī)測定。計算各個上樣體積下的回收率,確定最優(yōu)洗脫條件。
表3 洗脫液及體積對回收率的影響Table3 Effect of different elution solvent and volume on recoveries
從表3可以得出,同種洗脫液,隨著洗脫體積的增加,回收率逐漸增加;不同洗脫液在相同洗脫體積下,甲醇和乙腈回收率較好,當(dāng)使用甲醇或乙腈2mL洗脫黃曲霉毒素M1時,基本洗脫完全,洗脫液的量越大,氮吹耗時越大,甲醇沸點(diǎn)比乙腈低,氮吹消耗的時間越少,綜合考慮,本實驗選擇2mL甲醇為洗脫液。
3.4 pH值對測定結(jié)果的影響
按照GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定》中將液體奶處理方法,取一定量的液態(tài)奶樣品水浴加熱到35℃~37℃,離心,收集上清液,過免疫親和柱。對于酸奶樣品,上清液的pH通常在5~6之間,偏離免疫親和柱的pH使用范圍6~8,影響抗原抗體的結(jié)合,從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,使測定結(jié)果偏低,所以要用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到6~8,再過柱。本文選擇磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液,控制溶液的pH在免疫親和柱的使用范圍之內(nèi),避免調(diào)節(jié)溶液pH的過程。
本文利用乙腈對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行提取,有效的沉淀蛋白,避免了過柱堵塞問題,提高了過柱效率,同時乙腈比GB5413.37-2010《乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定》中液態(tài)乳的處理方法提取牛奶樣品中黃曲霉毒素M1更加充分,測定結(jié)果更能準(zhǔn)確反映牛奶中黃曲霉毒素M1的污染水平。通過回收率實驗對淋洗液和洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化,找出了淋洗液的最佳比例或體積,解決了洗脫液成渾濁的現(xiàn)象。該方法選擇了PBS緩沖液為稀釋液,有效的控制提取液的酸度在免疫親和柱適用范圍內(nèi),避免了單個樣品pH調(diào)節(jié)。該方法的線性范圍寬,回收率為89.1%~93.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.5%~9.7%之間,檢出限為0.01μg/kg,低于1/10現(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中黃曲霉毒素M1限量標(biāo)準(zhǔn),符合檢測要求,適用于對牛奶中黃曲霉素素M1的檢測。
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Determ ination of A flatoxin M1Content in M ilk by High-performance Liquid Chromatography
ZHOU Yi-bing,LINYe,LILei,WANGYa-fang,LIU Li-ya*
(Guizhou Center for Diseases Control and Prevention,Guiyang 550004,Guizhou,China)
Aflatoxin M1in milk were determinated using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.Aflatoxin M1in milk were firstly ultrasonic extracted,centrifuged,concentrated and then purified through immunoaffinity column,using 10%methanol aqueous solution leaching column,dried in nitrogen,volumed by10% acetonitrile aqueous.The ratio of addition acetonitrile,leaching solution and eluent were optimized. The results showed that the results showed that the ratio of the milk sample to acetonitrile was 1 to 2 inmass to volume could effectively precipitateprotein and avoid the column plug. Washing immunoaffinity column with 10 % methanol aqueous can effectivelyremove impurities and avoid the turbid phenomenon of eluent. The recovery of method with widely linearrange was between 89.1 % to 93.5 %,relative standard deviation between 6.5 % to 9.7 % and the detection limit is 0.01μg/kg which was less than1/10of current national food safety standards with limit the quantity of aflatoxin M1. The method can be applied to the determination the content of aflatoxin M1inmilk sample.
aflatoxin M1;milk;immunoaffinity column;high-performance liquid chromatography
10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.027
2013-06-26
周貽兵(1985—),男(漢),主管技師,碩士,主要研究領(lǐng)域:食品分析及科研。
*通信作者:劉利亞,男,副主任技師,主要從事于食品分析及科研。