陸生伊薩酵母生物降酸釀造樹莓干型酒工藝研究

隋韶奕，張素敏，*，文連奎，王雪松

（1.遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧營口115214；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

陸生伊薩酵母生物降酸釀造樹莓干型酒工藝研究

隋韶奕1，張素敏1，*，文連奎2，王雪松1

（1.遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧營口115214；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

以紅樹莓為原料，利用陸生伊薩酵母（Issatchenkia Terricola）進行生物降酸釀造全汁樹莓干型酒。通過正交試驗得到了最佳生物降酸條件：陸生伊薩酵母接種量3%、釀酒酵母接種量0.08%、降酸溫度為28℃、降酸時間為5 d。經(jīng)發(fā)酵所得樹莓干酒色澤為紅寶石色，無明顯懸浮物，口感圓潤淳厚，帶有典型的樹莓果香及和諧的醇香，無異味。

陸生伊薩酵母；生物降酸；樹莓干型酒；工藝研究

樹莓（Rubus spp.）又稱山莓、覆盆子等，是一種多年生落葉灌木果樹，果實屬漿果，其色澤艷麗，成串成簇，柔嫩多汁，風(fēng)味芳香，營養(yǎng)豐富，被賦予“黃金漿果”和“水果之王”的美稱。樹莓中有機酸含量超過2%，主要為檸檬酸及蘋果酸，檸檬酸含量超過總酸的90%[1-5]。

樹莓在全世界已有300多年的栽培歷史。我國早在上世紀二十年代就由俄羅斯引進樹莓，并開始對其進行生產(chǎn)性栽培。截止2008年，中國樹莓栽培面積達8 900 hm2，年產(chǎn)量5.5萬t[6-7]。樹莓果實不耐貯運，除了少量果實被鮮食和速凍外，大部分都要通過加工途徑被利用。在食品加工領(lǐng)域，常見的樹莓加工品有果汁、果醬、凍干果、果粉等[8]，但是在眾多樹莓加工品中，干型酒卻極為罕見。究其原因是由于樹莓本身的有機酸含量很高，以其為原料生產(chǎn)的全汁干型酒酸度大，口感酸澀，不易被廣大消費者所認可，而傳統(tǒng)的物理、化學(xué)降酸方法對樹莓酒的營養(yǎng)價值和口感影響較大，隨著近年來樹莓產(chǎn)量的不斷增加，樹莓加工品的日益熱銷，找到一種可應(yīng)用于樹莓干型酒生產(chǎn)中的降酸方法勢在必行。

1 材料與方法

1.1 降酸菌株來源及介紹

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程實驗室篩選出了一株以L-蘋果酸和檸檬酸為碳源的酵母菌，鑒定此酵母菌為伊薩酵母屬，陸生伊薩酵母種，代號S8。此酵母菌對1.2%以下的檸檬酸和2%以下的L-蘋果酸降解率均達80%以上，本研究將采用該菌種運用于樹莓酒的生物降酸中。

1.2 材料

紅樹莓：品種為海爾特茲，遼寧省果樹科學(xué)研究所提供；白砂糖：市售，符合GB317.7-1991《白砂糖》國家標(biāo)準要求；水：符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準》要求；果膠酶：天津利華酶制劑技術(shù)有限公司提供；高活性釀酒酵母：丹寶利果酒用酵母；殼聚糖及其他試劑：均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純或化學(xué)純。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ID型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KYC-1000C型空氣恒溫搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；其他：培養(yǎng)皿，溫度計，滴定管，三角瓶等。

1.4 方法

1.4.1 工藝流程

1.4.2 原料處理

挑選原料樹莓，剔除霉?fàn)€果后進行破碎，用斐林試劑滴定法測得總糖量為8%，用酸堿滴定法測得總酸量為1.74%。

1.4.3 酶解榨汁

向破碎后的果漿中加入果膠酶，添加量為0.035%，常溫下酶解4 h[9]。酶解結(jié)束后濾得清汁。

1.4.4 生物降酸

將菌種S8通過活化，一級培養(yǎng)、二級擴陪、三級擴陪得到菌懸液備用；將丹寶利果酒用干酵母，按1∶20投放于30℃溫水，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱活化30min，制成菌懸液備用。

根據(jù)單因素試驗所得到各試驗參數(shù)的基本范圍，以降酸菌株S8接種量（A），釀酒酵母接種量（B），降酸溫度（C），降酸時間（D）為因素進行L9（34）正交試驗，以樹莓汁中可滴定酸下降量為指標(biāo)篩選最佳生物降酸工藝參數(shù)。

1.4.5 加熱殺菌

生物降酸結(jié)束后，將發(fā)酵液快速加熱到70℃后維持20min，以殺滅發(fā)酵液中殘存的降酸菌及釀酒酵母，然后迅速冷卻至室溫。

1.4.6 調(diào)整成分

干型酒的酒精度一般為12%（體積分數(shù)），釀造所需含糖量為20.4%，而本試驗中所用試材樹莓含糖量為8%，為滿足含糖量要求，在本試驗試材中添加12.4%的白砂糖。

1.4.7 主發(fā)酵

向調(diào)整成分后的發(fā)酵液中再次接入0.1%[以干酵母重量計]的釀酒酵母，在20℃～25℃條件下進行主發(fā)酵。

1.4.8 后發(fā)酵

發(fā)酵液總糖量低于0.4%時，主發(fā)酵結(jié)束，通過倒桶，將發(fā)酵罐中沉淀物與酒液分離，保持15℃～20℃，發(fā)酵15 d～20 d。

1.4.9 澄清

采用殼聚糖作為澄清劑，添加量為0.06%，將殼聚糖用2%檸檬酸配制成1%溶液，浸泡24 h后直接添加進樹莓酒中。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適生物降酸工藝路線的確定

表1 菌株S8特性[10]Table1 The characteristic of S8

本試材樹莓總糖含量為8%，成分未經(jīng)調(diào)整的果汁，發(fā)酵后可產(chǎn)生的酒精濃度不會超過4.7%，由表1可以看出，對陸生伊薩酵母S8的生長繁殖不會產(chǎn)生抑制作用，而且樹莓自身香氣成分對熱穩(wěn)定性較好，加熱后香氣散失并不明顯。所以，在本試驗中可采用兩種降酸方法。方法一，先在樹莓果汁中接入降酸菌株S8，待含酸量降至理想范圍后加熱殺菌，調(diào)整果汁成分，再接入釀酒酵母進行酒精發(fā)酵；方法二，在樹莓果汁中同時接入降酸菌株S8和釀酒酵母，使生物降酸和酒精發(fā)酵同時進行，當(dāng)果汁含酸量降至理想范圍內(nèi)，加熱殺菌后調(diào)整果汁成分，再次接入釀酒酵母完成后續(xù)酒精發(fā)酵。

分別采用兩種處理方法，考察降酸量及處理后果汁品質(zhì)，以確定最適生物降酸工藝路線。釀酒酵母接種量[以干酵母計]為0.1%，S8接種量[以菌懸液計]為3%，試驗溫度為28℃，為菌株S8的最佳接種量及最適培養(yǎng)溫度[11]，培養(yǎng)時間為5 d。

圖1 不同生物降酸方法的影響Fig.1 The influence of different biological acid-degradation

由圖1所示，經(jīng)過5 d降酸處理，兩種方法在降酸量上區(qū)別并不明顯，但從感官品質(zhì)上則區(qū)別較大，采用方法一的試樣帶有酸臭異味；采用方法二的試樣無異味，樹莓香氣明顯。由此分析，方法二在生物降酸的同時進行酒精發(fā)酵，產(chǎn)生的酒精可在一定程度上抑制雜菌的生長，而且較方法一縮短了釀造時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本，因此，確定方法二為最優(yōu)降酸工藝路線。

2.2 S8接種量對生物降酸的影響

將接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的S8菌懸液（＞106cfu/mL）接入樹莓汁中，同時接入接種量（以干酵母重量計）為0.1%的釀酒酵母，28℃下降酸發(fā)酵4 d后，分別測定其降酸量。

圖2 S8接種量對生物降酸的影響Fig.2 Effect of S8 inoculation on the biological acid-degradation

由圖2所示，隨著S8接種量的增加，降酸量逐漸增大，但當(dāng)接種量超過3%后，提高接種量對降酸量的影響不大，考慮到生產(chǎn)成本以及對樹莓酒口感的影響，優(yōu)選出3個接種量分別為2%、3%、4%進入正交試驗。

2.3 釀酒酵母接種量對生物降酸的影響

將接種量為3%的S8菌懸液（＞106cfu/mL）接入樹莓汁中，同時接入接種量（以干酵母重量計）分別為0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%的釀酒酵母接入樹莓汁中，28℃下降酸發(fā)酵4 d后，分別測定其降酸量。

由圖3所示，釀酒酵母接種量越小，降酸量越大，但當(dāng)接種量為0.04%時，發(fā)酵液中有雜菌產(chǎn)生，說明釀酒酵母添加量過小，產(chǎn)生的酒精濃度不足以抑制雜菌的生長。當(dāng)接種量超過0.08%時降酸量呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)接種量達到0.1%后降酸量下降明顯，說明釀酒酵母接種量過大導(dǎo)致發(fā)酵速度加快，提高了酒精濃度的升高速度，過早的抑制了降酸菌S8的活性，從而影響了降酸效果。根據(jù)上述結(jié)果，優(yōu)選出3個釀酒酵母接種量分別為0.06%、0.08%、0.1%作為正交試驗水平。

圖3 釀酒酵母接種量對生物降酸的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculation quantity on the biological acid-degradation

2.4 溫度對生物降酸的影響

將接種量為3%的S8菌懸液（＞106cfu/mL）接入樹莓汁中，同時接入接種量（以干酵母重量計）為0.1%的釀酒酵母，分別在24、26、28、30、32℃下降酸發(fā)酵4 d后，分別測定其降酸量。

圖4 溫度對生物降酸的影響Fig.4 Effect of temperature on the biological acid-degradation

由圖4所示，在培養(yǎng)溫度為24℃時，降酸量較低，隨著培養(yǎng)溫度的上升，降酸量也增大，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，降酸量趨于平緩，當(dāng)溫度升高到30℃以上時，降酸量隨即下降。根據(jù)上述結(jié)果，優(yōu)選出3個培養(yǎng)溫度分別為26、28、30℃進入正交試驗。

2.5 時間對生物降酸的影響

將接種量為3%的S8菌懸液（＞106cfu/mL）接入樹莓汁中，同時接入接種量（以干酵母重量計）為0.1%的釀酒酵母，28℃下降酸發(fā)酵2、3、4、5、6 d后，分別測定其降酸量。

由圖5所示，隨著降酸時間的增加，降酸量逐漸增加，但當(dāng)降酸時間超過4 d后，發(fā)酵液中可作為降酸菌S8碳源的葡萄糖已經(jīng)基本被消耗掉，其他碳源L-蘋果酸和檸檬酸的濃度也已經(jīng)降低，而且乙醇發(fā)酵所產(chǎn)生的酒精濃度不斷增大，已經(jīng)開始對S8產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致降酸菌數(shù)量下降，降酸能力減弱，降酸量趨于穩(wěn)定?？紤]到節(jié)約時間成本，優(yōu)選出3個降酸時間分別為3、4、5 d作為正交試驗水平。

圖5 時間對生物降酸的影響Fig.5 Effect of time on the degradation of acid

2.6 樹莓酒生物降酸正交試驗結(jié)果與分析

表2 正交試驗結(jié)果Table2 Results of orthogonal test

表2中R值表明：陸生伊薩酵母S8對樹莓酒生物降酸試驗中，影響降酸量的最大因素為D，各因素影響的主次順序為D＞C＞B＞A，以降酸量為指標(biāo)，最佳條件組合為A2B2C2D3。此處理未在正交試驗中，為此又做了驗證性試驗，如表3所示。

表3 驗證性試驗結(jié)果Table3 Results of confirmatory trials

在該條件下測得降酸量為1.13%，高于正交試驗組最佳組合A2B1C2D3的降酸量1.1%，因此陸生伊薩酵母S8對樹莓酒生物降酸的最佳工藝條件為：A2B2C2D3，即S8接種量為3%、釀酒酵母接種量為0.08%、降酸溫度為28℃、降酸時間為5 d。

由正交試驗結(jié)果可以看出，接入陸生伊薩酵母S8后，降酸時間越長，降酸量越大，尤其在S8生長到達穩(wěn)定期后，表現(xiàn)會更為突出，因此降酸時間在樹莓酒生物降酸試驗的各因素中影響最大。溫度對菌株S8活性的影響是決定性的，溫度過高會導(dǎo)致S8因疲勞而死亡，溫度過低則會使S8的活性降低，對降酸效果產(chǎn)生影響。釀酒酵母接種量的大小，會對菌株S8的生長產(chǎn)生影響，釀酒酵母接種量偏大，會在接種初期，與同處于對數(shù)生長期的陸生伊薩酵母S8爭奪生長所需的碳源和氮源，而且會提高產(chǎn)酒精的速度，過早的抑制了S8的活性。

3 結(jié)論

本試驗以新鮮紅樹莓海爾特茲為原料，以吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室篩選保存的陸生伊薩酵母菌株S8作為降酸菌，通過生物降酸釀造優(yōu)質(zhì)樹莓干型酒，在S8接種量（以菌懸液計）為3%、釀酒酵母接種量（以干酵母重量計）為0.08%、降酸溫度為28℃、降酸時間為5d的條件下，樹莓酒中可滴定酸含量下降1.13%。最終經(jīng)過發(fā)酵得到酒精度11.6%（體積分數(shù)，20℃），總糖2.35 g/L，色澤為紅寶石色，帶有典型果香的樹莓干型酒。

[1]劉春菊,宣景宏,孟憲軍.樹莓的營養(yǎng)價值及發(fā)展前景[J].北方果樹,2004(12):57-58

[2]王文芝.樹莓果實營養(yǎng)成分初報[J].西北園藝,2001(2):13

[3]宣景宏,孟憲軍,辛廣,等.樹莓果皮及果肉揮發(fā)性成分分析研究初報[J].北方果樹,2006(1):8-9

[4]姜河,修英濤,蔡騫.我國樹莓發(fā)展現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)化前景分析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(2):45-48

[5]王文芝.樹莓果實營養(yǎng)成分初報[J].西北園藝,2001(2):13

[6]李亞東,吳林,張志東.我國樹莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的探討[J].中國食物與營養(yǎng),2001(6):13-15

[7]張清華,董鳳祥.樹莓發(fā)展現(xiàn)狀與前景[J].林業(yè)實用技術(shù),2007(l1): 9-13

[8]黃慶文.新興果樹——樹莓[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,1997(10):17

[9]畢金峰,魏寶東.酶法提取樹莓汁的研究[J].食品科學(xué),2002(12): 83-85

[10]王立芳.一株可降解L-蘋果酸和檸檬酸菌株的鑒定及降解特性研究[D].吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011

[11]王立芳,張薇,文連奎.可降解L-蘋果酸和檸檬酸的菌株篩選及鑒定[J].食品科學(xué),2010(21):279-282

Use Issatchenkia Terricola Brewing Technique of Raspberry Wine by Biological Acid-degradation

SUI Shao-yi1，ZHANG Su-min1，*，WEN Lian-kui2，WANG Xue-song1
（1.Liaoning Institute of Pomology，Yingkou 115214，Liaoning，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

Research using the red raspberry as material and Issatchenkia Terricola as de -acidification yeast during brewing of pure juice wine， the following results were achieved or recorded. We came to a conclusion of the optimum acid -degradation condition by the single factor trial and orthogonal test： Issatchenkia Terricola inoculum size was 3 %， the Brewers yeast inoculum size was 0.08 %， the temperature of de-acidification was 28℃，and de-acidification time was 5 d. Product quality index of raspberry wine is as follow： its colour was ruby， with no obvious suspensions， The palate stable， with a typical aromas of raspberries and harmonious flavour.

Issatchenkia Terricola；biological acid-degradation；raspberry wine；technical study

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.013

2013-04-10

遼寧省科技廳（20102223）

隋韶奕（1981—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：果品貯藏加工。

*通信作者：張素敏（1972—），女，助理研究員，碩士，研究方向：有效物質(zhì)提取。