湯尚文,豁銀強(qiáng),吳進(jìn)菊,費(fèi) 鵬
(1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院,湖北襄陽441053; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技術(shù)學(xué)院,湖北武漢430070)
黃酒是以稻米、小米、玉米、黍米、小麥等為主要原料,經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒[1]。它是世界上最古老的酒種之一,與葡萄酒、啤酒并稱為世界三大古酒,被譽(yù)為中國的“國酒”[2]。黃酒含有豐富的氨基酸、肽類、低聚糖、維生素及礦物質(zhì)微量元素,歷來以營養(yǎng)豐富、保健養(yǎng)生著稱[3]。
由于著名的“法國矛盾”,紅酒的保健功能引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。研究表明,紅酒中含有大量的多酚類物質(zhì),這是一類很強(qiáng)的體外抗氧化劑,它們通過阻止氧自由基的初始反應(yīng)或干擾其鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來防止氧化反應(yīng)的發(fā)生,可以清除機(jī)體內(nèi)自由基,減輕和消除機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激[4],降低心血管疾病的發(fā)病率。自由基學(xué)說很好地解釋了氧化作用,認(rèn)為自由基具有高度的化學(xué)活性,體內(nèi)自由基過多,可導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷、誘發(fā)各種疾病、加速機(jī)體衰老,最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[5]。雖然人體自身具有內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制,但外源性抗氧化劑在抵御自由基的侵害時(shí)也是必不可少的[6]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明:自由基和脂質(zhì)過氧化與衰老、癌癥及炎癥等疾病有著直接聯(lián)系,因此能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的物質(zhì)成為目前研究的一大熱點(diǎn)[7]。
與葡萄酒相比,黃酒同樣富含大量抗氧化生物活性成分,尤其在功能性多肽的種類和含量上,黃酒猶有勝之[8]。本文通過查閱近幾年來國內(nèi)外黃酒抗氧化研究方面的文獻(xiàn),歸納整理并分析探討了黃酒及其所含的各類生物活性成分的抗氧化作用,較為系統(tǒng)地綜述了黃酒抗氧化作用的研究進(jìn)展,以期為黃酒的開發(fā)利用提供理論參考。
根據(jù)抗氧化作用的機(jī)理不同,一般來說,抗氧化成分可分為兩大類:一類是直接抗氧化成分,即在生物體外有自由基清除能力或還原能力;一類是間接抗氧化成分,即在體外無自由基清除能力或還原能力,但能明顯提高生物機(jī)體體內(nèi)抗氧化狀態(tài),如體內(nèi)抗氧化酶的輔酶因子以及抗氧化劑的前體物質(zhì)[9]。
根據(jù)測定目標(biāo)的不同,抗氧化活性的測定方法可以分為體外抗氧化活性測定、體內(nèi)抗氧化活性測定和離體抗氧化活性測定。其中,以在體外抗氧化活性的測定最為方便,也是目前研究最多的。
體外抗氧化活性的測定主要是通過測定對各類活性氧自由基的清除能力或是對脂質(zhì)過氧化的抑制能力來判斷[10-11]。常用抗氧化能力測定方法主要有以下幾種:總抗氧化能力測定法(TRAP法)、鐵離子還原/抗氧化能力測定法(FRAP法),氧自由基吸收能力法(TOSC法)、1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基清除法(DDPH法)、2,2'-連氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽自由基清除法(ABTS法,又稱TEAC法)、化學(xué)發(fā)光法、β-胡蘿卜素亞油酸體系法、低密度脂蛋白氧化反應(yīng)、福林酚法等[12]。按測定手段來劃分,可分為比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、電子自旋共振法(ESR)等??寡趸芰?qiáng)弱的表達(dá)方式主要有抑制率、半抑制濃度(IC50)、抗氧化效率(AE)等[13]。體外抗氧化活性的測定僅僅是針對在生物體外有自由基清除能力或還原能力的直接抗氧化成分,而無法反映間接抗氧化成分的作用,所以只能部分地反映黃酒抗氧化能力的強(qiáng)弱。
體內(nèi)抗氧化活性的測定包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn),主要從抑制機(jī)體氧化損傷和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御這兩個(gè)方面來研究黃酒的抗氧化活性:一方面,通過檢測機(jī)體內(nèi)易受氧化損傷的生物標(biāo)志物的水平變化來對其抑制氧化損傷的能力進(jìn)行表征。例如:脂質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志物有氧化型低密度脂蛋白(LDL)、丙二醛(MDA)和8-異前列腺素(8-iso PGF2α)等[14];蛋白質(zhì)氧化損傷標(biāo)志物有3-硝基酪氨酸、蛋白質(zhì)羰基(PCC);DNA氧化損傷標(biāo)志物有8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷等[9]。另一方面,可以通過檢測機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶和非酶抗氧化劑的活性和水平的變化來表征其增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力,主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽酶類(GSH-Px,GSSG-Tr)等抗氧化酶及維生素E等非酶抗氧化劑[15-16]。
除此之外,對黃酒的抗氧化活性的測定還有離體抗氧化活性測定,包括組織氧化抑制研究法、離體生物大分子研究法和細(xì)胞內(nèi)抗氧化研究法(CAA)[9,17]。由于抗氧化成分經(jīng)過生理過程攝入到血漿相較于直接添加到血漿,抗氧化效果存在明顯差別,所以離體實(shí)驗(yàn)只能在某種程度上預(yù)測抗氧化成分的生理功效,其抗氧化活性最終還是必須由體內(nèi)抗氧化活性確定。
大量的研究表明黃酒有較強(qiáng)的抗氧化能力。Fei等[18]曾對紹興黃酒的總抗氧化活性和自由基清除率等進(jìn)行分析,結(jié)果表明黃酒的總抗氧化能力、還原能力、清除DPPH自由基、超氧陰離子的能力均較強(qiáng)。俞劍燊等[19]報(bào)道了長期喂食和酒(一種保健型黃酒)的小白鼠體內(nèi)谷胱甘肽的含量為174μmol/g,普通黃酒中喂食的小白鼠體內(nèi)谷胱甘肽的含量也達(dá)到了110μmol/g,遠(yuǎn)高于普通飼養(yǎng)小白鼠的40μmol/g;喂食和酒的小白鼠體內(nèi)過氧化脂質(zhì)含量顯著低于長期喂食乙醇的小白鼠,和酒可以有效防止肝組織的酒精性損傷。
黃酒的抗氧化性能與很多因素有關(guān),如種類、產(chǎn)地、陳化時(shí)間等。闕斐等[20]以總抗氧化能力、還原能力、清除DPPH自由基能力為指標(biāo),研究比較了紅曲酒、佛手酒和糯米酒的抗氧化活性。結(jié)果表明:3種黃酒均具有明顯的抗氧化活性,其中以糯米酒最強(qiáng),佛手酒最弱。鄭校先等[21]對三年陳、五年陳黃酒的抗氧化能力進(jìn)行了初步檢測分析,研究結(jié)果表明:三年陳黃酒的總抗氧化能力比五年陳黃酒強(qiáng),但還原能力卻要弱,對 DPPH自由基的清除能力分別為53.3%、46.9%,抗超氧陰離子活力單位分別為50 U/L和60U/L,這些差異與黃酒在陳化過程中成分的變化有關(guān)。莊瑋婧等[22]研究發(fā)現(xiàn)黃酒保存時(shí)間越長,抗氧化能力越弱,這可能是由于黃酒中的抗氧化物質(zhì)如多酚被氧化造成的;另外黃酒清除羥自由基能力和總抗氧化能力并不總是一致,說明了黃酒中抗氧化成分與機(jī)理的復(fù)雜性。
植物多酚是最廣為人知的天然抗氧化物質(zhì)之一。多酚的酚羥基結(jié)構(gòu)尤其是鄰苯二酚或鄰苯三酚中的鄰位酚羥基具有很強(qiáng)的捕捉活性氧等自由基的能力,很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu),能夠減少或阻止機(jī)體組織中氧化反應(yīng)過程的進(jìn)行,許多研究證實(shí)其有延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、癌癥等生理功能[23]。
黃酒中同樣富含酚類物質(zhì),主要來源于微生物(酵母、米曲霉)和原料(小麥、大米)的轉(zhuǎn)換,由于小麥帶皮發(fā)酵,再加上黃酒發(fā)酵周期長達(dá)80~90天,麥皮中的酚類物質(zhì)大量溶入酒中[24]。Tu等[25]研究發(fā)現(xiàn)燕麥黃酒中多酚含量達(dá)到153.74μg/mL,大大增加了高脂老鼠體內(nèi)的SOD和GSH-PX活性,降低了MDA、血膽固醇和甘油三酸酯水平。孟如杰[26]研究了嘉善黃酒的自由基的清除能力與酚類物質(zhì)含量的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)黃酒的抗氧化性主要來源于3種酚類物質(zhì)(兒茶酚、沒食子酸、丁香酸)。闕斐等[20]利用高效液相色譜(HPLC)從三種黃酒(紅曲酒、佛手酒、糯米酒)鑒定出10種酚類物質(zhì),包括咖啡酸、蕓香苷、紫丁香酸、表兒茶素、沒食子酸、兒茶素、香豆酸、阿魏酸、香草酸和槲皮苷,紅曲、佛手、糯米酒中酚類總量分別達(dá)到65.28、28.98和108.73μg/mL,其含量與黃酒的抗氧化能力呈正相關(guān)。鄭校先[21]等測得的黃酒中酚類物質(zhì)含量為249μg/mL。葉杰等人[27]采用Folin-ciocalteu分光光度法對五種黃酒(閩江老酒、青紅酒、福建老酒、沉缸酒、紹興花雕)中的總多酚進(jìn)行測定,測得結(jié)果分別為929、726、1046、1164、986μg/mL。黃酒中的多酚在不同程度地影響了黃酒的抗氧化能力,在不同種類的黃酒中,多酚含量差異很大,這是由產(chǎn)地,選用的水源,原料及酒曲的不同所造成的[28]。黃酒中多酚含量一般要低于葡萄酒,但這并不意味黃酒的抗氧化活性就一定比葡萄酒差,因?yàn)辄S酒的成分比葡萄酒更為復(fù)雜。除酚類物質(zhì)以外,黃酒中其他抗氧化成分也很豐富,如維生素、肽類、多糖、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)等都會(huì)對增強(qiáng)黃酒的抗氧化能力。
黃酒蛋白質(zhì)的含量是釀造酒中最高的,主要以肽和氨基酸的形式存在。據(jù)分析檢驗(yàn),黃酒中含有18種以上氨基酸,其中人體不能合成的8種必需氨基酸含量在酒類中最全、最豐富[29]。黃酒中的含氮物質(zhì)有2/3是氨基酸,其余的1/3是寡肽和多肽[30]。據(jù)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與衛(wèi)生研究所編定的最新版“食物成分表”顯示,黃酒中蛋白質(zhì)含量為1.7g/100mL,比白酒多70%,比啤酒多4.25倍,黃酒中氨基酸含量為1346.67mg/100mL,比白酒多2.09倍,比啤酒多7.55倍。諸葛慶等人[31]的研究表明:福建黃酒和紹興黃酒的氨基酸平均含量較高,分別達(dá)到3726.80mg/L和3946.56mg/L,江西黃酒氨基酸含量較低,平均為1634.33mg/L。
目前已有大量研究表明,很多氨基酸具有抗氧化性。龐坤等[32]研究發(fā)現(xiàn)組氨酸對DPPH·有良好的清除作用,可以有效地抑制牛血清白蛋白的氧化;徐穎等[33]研究發(fā)現(xiàn)蒜氨酸對·和·OH具有良好的清除作用,其對·最大清除率達(dá)到40.94%,對·OH最大清除率達(dá)到21.56%。另外,黃酒富含具有保健功能的γ-氨基丁酸(GABA),GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),參與多種代謝活動(dòng),具有改善腦功能、增強(qiáng)長期記憶、抗焦慮及提高肝、腎機(jī)能等生理活性[34-35],倪瓚[36]用黃酒灌喂小白鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其記憶能力明顯提高,這可能就是黃酒中的GABA的作用,同時(shí)有大量研究報(bào)道GABA有很強(qiáng)的抗氧化性。王中華等[37]研究表明:添加一定量的GABA可以明顯提高肥育豬的SOD酶和GSH-Px酶的活性,降低MDA的含量。秦旺華等[38]報(bào)道了脊椎動(dòng)物緊張時(shí)大腦會(huì)嚴(yán)重缺氧,在后重新供氧的原始條件下腦組織會(huì)遭受大量氧自由基的攻擊,但龜腦中γ-氨基丁酸可以有效抵抗龜腦中的活性氧自由基的生成,從而保護(hù)腦組織,這可能就是龜類長壽的原因。謝廣發(fā)[39]采用OPA-FMOC柱前衍生HPLC測定了古越龍山紹興黃酒中的GABA,發(fā)現(xiàn)黃酒中GABA的含量為170~360mg/L,顯著高于在正常情況下植物體中GABA的含量為3~200mg/kg。
近年來的研究表明,相較于氨基酸,以數(shù)個(gè)氨基酸結(jié)合成的低肽具有更好的吸收效果,而且許多多肽具有原蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所沒有的生理功能,如清除自由基、抗氧化、促鈣吸收、降膽固醇、降血壓、抗癌、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)等[24]。孟如杰[26]研究發(fā)現(xiàn)黃酒的抗氧化活性有一部分源于多肽,并分析了其氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)這些具有抗氧化活性的多肽大多富含賴氨酸、亮氨酸、精氨酸等氨基酸。黃酒在發(fā)酵過程中酵母會(huì)分泌和自溶產(chǎn)生大量還原型谷胱甘肽(GSH)[40],GSH是生物細(xì)胞質(zhì)中合成的一種肽,具有強(qiáng)抗氧化性,由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸組成,含有巰基(-SH),可通過巰基與生物機(jī)體內(nèi)的自由基結(jié)合轉(zhuǎn)化為容易被代謝的酸類物質(zhì),從而加速體內(nèi)自由基的排泄[19],達(dá)到抗氧化的效果。俞劍燊等[19]研究發(fā)現(xiàn)和酒中GSH含量高達(dá)174μmol/L,對肝的酒精性損傷有明顯的防護(hù)作用。
另外,謝廣發(fā)[41]對古越龍山黃酒中的肽類組分進(jìn)行提純和降血壓、降膽固醇的體外活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)酒中含具有活性很強(qiáng)的降血壓和降膽固醇生物活性肽,并分析鑒定出四個(gè)降血壓活性肽的氨基酸序列和組成為Gln-Ser-Gly-Pro,Val-Glu-Asp-Gly-Gly-Val,Pro-Ser-Thr,Asn-Thr,一個(gè)降膽固醇生物活性的氨基酸序列和組成為Cys-Gly-Gly-Ser。戴軍等人[42]分析鑒定出了古越龍山黃酒中4種可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性的小肽,其氨基酸序列為 Val-Glu-Asp-Gly,Gly-Val,Pro-Ser-Thr,Asn-Thr。
黃酒中的抗氧化物質(zhì)物質(zhì)的產(chǎn)生還與其陳化過程中發(fā)生諸多的化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。黃酒中氨基酸和多肽除了可以直接抗氧化外,還容易與羰基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng),生成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)同樣具有抗氧化作用[7]。
美拉德反應(yīng)是黃酒在陳化過程中發(fā)生的一類重要反應(yīng),黃酒在陳化過程中顏色不斷加深正是由美拉德反應(yīng)生成的類黑精不斷增多造成的。江偉等[43]利用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對不同酒齡的黃酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)黃酒中的MRPs (主要是醛類)含量隨著酒齡增長不斷上升,其中5-甲基糠醛、糠醛和苯甲醛在1~12年中增加的比例為10~40倍。
近20年來,很多研究者發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的抗氧化作用[44]。葉杰[23]用活性炭吸附和HPLC分離福建黃酒中的活性物質(zhì),發(fā)現(xiàn)一類有色物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化活性,經(jīng)紅外光譜及質(zhì)譜分析,推測其可能是MPRs。陳娟[45]提取了甜型福建黃酒中的的色素,發(fā)現(xiàn)提取液有較高的清除DPPH自由基的能力,推測其可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有關(guān),并利用高效液相色譜熒光分析法對其美拉德反應(yīng)的終了階段產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)從中分離出的5種成分均具有一定的DPPH自由基清除能力,這證明MPRs確實(shí)對黃酒的抗氧化活性做出了貢獻(xiàn)。
范懷德等[29]分析出黃酒中含有豐富的維生素C、維生素A、維生素E和B族維生素,這些維生素主要來源于原料和酵母的自溶物。黃酒原料(糯米、小麥、黍米)含有大量的B族維生素,而維生素E在小麥胚中的含量很高,可以達(dá)到554mg/kg;酵母同樣富含維生素,由于黃酒的發(fā)酵周期較長,酵母細(xì)胞會(huì)自溶釋放出的大量的維生素,而這些維生素很多具有抗氧化活性,可以直接抗氧化或通過增強(qiáng)體內(nèi)其他抗氧化劑的活性來抗氧化[46]。
黃酒中含有豐富的低聚糖,主要來源于兩部分,一是支鏈淀粉酶解產(chǎn)生的,另一部分是由麥曲中的微生物所分泌的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶催化轉(zhuǎn)糖苷作用合成的。謝廣發(fā)等[47]利用HPLC法測定了黃酒中低聚糖含量,結(jié)果表明黃酒中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖含量很高,分別達(dá)到1.0481、0.9850、0.5111mg/mL,遠(yuǎn)高于啤酒和紅酒。彭金龍[48]利用醇沉方法提取了黃酒中的多糖并研究了其體外抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃酒粗多糖與精制多糖都具有較高的抗氧化活性,且與濃度存在一定的量效關(guān)系;精制黃酒多糖的在總抗氧化能力及其對羥基自由基和DPPH自由基的清除能力要強(qiáng)于黃酒粗多糖,而在清除超氧陰離子的能力上要弱于黃酒粗多糖。
無機(jī)鹽是構(gòu)成機(jī)體組織和維護(hù)機(jī)體正常生理功能所必須的,黃酒中檢測出的無機(jī)成分達(dá)18種之多,主要有鎂、鈣、磷、鉀等常量元素和硒、鋅、鐵、銅等微量元素,這些無機(jī)成分很多都會(huì)增加黃酒的抗氧化活性。目前已經(jīng)證明,鎂對生物的抗氧化機(jī)能有很大影響。在組織[49]、血漿脂蛋白[50]、活體小鼠肝臟和離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞的研究中都發(fā)現(xiàn),缺鎂會(huì)使組織脂質(zhì)的過氧化程度增加。Jay[51]以不同含量鎂飼料喂養(yǎng)小鼠,三周后的測定發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),小鼠的脂質(zhì)過氧化隨鎂攝入量的增加明顯降低。鎂對生物的抗氧化機(jī)能影響的機(jī)理十分復(fù)雜,主要是通過影響生物體內(nèi)抗氧化物質(zhì)(如GSH、VE等非酶物質(zhì)以及GSH-Px、SOD、CAT等酶性物質(zhì))而產(chǎn)生作用。
此外,黃酒是酒類產(chǎn)品中硒含量最高的,約比紅酒高12倍,是白葡萄酒的20倍[3]。硒有很高的抗氧化性,這是其發(fā)揮生理生化作用的基礎(chǔ),主要包括參與合成具有抗氧化活性的非酶硒化合物和含硒磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶、含硒谷胱甘肽過氧化物酶等,以及在維生素E的抗氧化過程中起到協(xié)同作用[52]。
黃酒中含鋅量同樣較高,如紹興元紅黃酒每100mL約含鋅0.85mg。鋅的抗氧化機(jī)制目前主要傾向于兩種觀點(diǎn):一是鋅保護(hù)生物膜上巰基,使其免遭氧化,增強(qiáng)膜穩(wěn)定性;二是會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生金屬硫蛋白,進(jìn)而抑制一些過渡態(tài)的金屬離子產(chǎn)生活性氧[53]。
黃酒作為中國最古老的酒,享有“國酒”美譽(yù),含有豐富的營養(yǎng)保健成分和較高的抗氧化活性。隨著人們對于抗氧化認(rèn)知和需求的不斷增加,對于黃酒抗氧化活性及其相應(yīng)成分的研究也不斷深化。目前,已經(jīng)有了不少關(guān)于黃酒抗氧化的研究和報(bào)道,但與紅酒以及同中國黃酒一樣的稻米酒——日本清酒相比,這些研究還很欠缺,檢測技術(shù)、實(shí)驗(yàn)方法、檢測指標(biāo)等都還需要進(jìn)行規(guī)范可靠和系統(tǒng)科學(xué)的整理和規(guī)定。
黃酒成分相對復(fù)雜,尤其是豐富的多肽成分可以成為黃酒區(qū)別于其他酒類的亮點(diǎn),而目前對于多肽的研究主要集中在分子量為1000u的多肽上,對于其功能的研究也主要局限在降血壓上。因此對于黃酒抗氧化成分的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及抗氧化機(jī)理的研究等工作已經(jīng)迫不及待;對于不同產(chǎn)地、不同酒齡的黃酒抗氧化活性及其相應(yīng)成分的差異目前仍然缺乏系統(tǒng)性的研究,這也應(yīng)該是今后研究工作的一個(gè)重點(diǎn);關(guān)于黃酒中抗氧化成分之間的關(guān)系——協(xié)同作用(如硒與VE)以及拮抗作用(如硒與鋅)同樣有待進(jìn)一步的研究。
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