色譜技術在檢測牛奶中激素類藥物殘留的應用

劉長姣，郭鑭，袁述，孟憲梅，余平

(1. 吉林工商學院 糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室 吉林 長春 130062；2. 吉林工商學院 食品工程分院，吉林 長春 130062)

牛奶及其制品營養(yǎng)豐富，已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹饕澄镏?。在奶牛飼養(yǎng)過程中，為促進奶牛生長、提高牛奶產(chǎn)量，人們會違規(guī)使用激素類藥物，進而導致牛奶中激素殘留問題日益嚴重。根據(jù)實驗室研究和流行病學調(diào)查結果，激素類藥物殘留可通過食物鏈(動物體內(nèi)殘留)和環(huán)境(飲用水及排泄物)對人體健康和動物健康、社會和生態(tài)環(huán)境造成直接和潛在的危害[1-4]。2004目前世界上許多國家和地區(qū)已經(jīng)禁用了相關激素類物質(zhì)或?qū)ζ渥龀隽藝栏褚?guī)定。例如歐盟、日本和中國對牛奶中皮質(zhì)激素中的倍他米松的最大殘留限量為 0.3μg/kg，食品法典委員會（CAC）規(guī)定最大殘留限量為0.05μg/kg，對雌激素中的己烯雌酚中國和日本均要求不得檢出。在檢測牛奶中獸用激素類藥物殘留的過程中，因為激素類藥物結構相似、理化性質(zhì)與許多內(nèi)源性成分相近，其殘留濃度可能接近或稍高于生理水平，所以對結果評判的準確性要求較高，并且需要有效的樣品前處理和高靈敏度的分析設備來保證理想的分析靈敏度、選擇性、專屬性和準確性。由此可見利用有效的檢測技術來準確的測定和監(jiān)控牛奶中激素類藥物的殘留是檢測領域的熱點和難點[5]。

檢測技術的進步是解決此問題的關鍵。隨著色譜技術和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術的進步，液相色譜、氣相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術在牛奶中激素殘留檢測過程中發(fā)揮了重要作用。本文綜述了色譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術在檢測牛奶中五類激素的研究進展。

1 牛奶中激素類藥物殘留的原因及危害

牛奶中殘留的激素來源主要來自兩方面，一是奶牛自然生長過程中產(chǎn)生的激素，二是人為添加激素。在奶牛喂養(yǎng)過程中，人為添加激素有助于提高牛奶的產(chǎn)量、飼料轉(zhuǎn)化率和藥理作用人工化，如人為的抑制動物發(fā)情、增強食欲等，從而提高經(jīng)濟效益。無論是在允許或禁止使用激素類物質(zhì)作為促生長劑的國家和地區(qū)，經(jīng)濟利益的驅(qū)動通常會導致激素類藥物的濫用[5]。研究結果顯示，牛奶中殘留的性激素對人體的生殖系統(tǒng)和生殖功能造成嚴重影響，食用殘留性激素的牛奶或其制品，顯著增加患前列腺癌或更年期乳腺癌的幾率[5-6]。青春期前兒童體內(nèi)產(chǎn)生雌激素少，暴露于外源性激素，可能使其生長加速或出現(xiàn)乳房發(fā)育。

2 色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用在激素殘留檢測中的優(yōu)勢

現(xiàn)代色譜技術主要包括氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、各種薄層色譜(TLC)以及超臨界流體色譜(SFC)等各種色譜和色譜聯(lián)用技術。在牛奶及奶制品毒害物質(zhì)殘留檢測方面，氣相色譜與液相色譜及它們與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術應用最多[7-8]，各檢測技術的優(yōu)缺點見表1。高效液相色譜法和氣相色譜法具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高等特點，但包括它們在內(nèi)的色譜技術的主要缺點是定性能力較差。而質(zhì)譜的多種掃描方式和質(zhì)量分析技術，可以有選擇的只檢測所需要的目標化合物的特征離子，而不檢測不需要的質(zhì)量離子，如此專一的選擇性，不僅能排除基質(zhì)和雜質(zhì)峰的干擾，還極大地提高了檢測靈敏度。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法是將高分離能力的色譜技術與高靈敏、高專屬性的質(zhì)譜技術聯(lián)接起來，成為一種多用途、高靈敏的定性、定量分析方法。色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的優(yōu)勢體現(xiàn)在可獲得質(zhì)量、保留時間、強度三維信息，所以已越來越多地被應用于牛奶及奶制品激素類藥物殘留的檢測。在方法的選擇上使用最多的是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜等[9-14]。

表1 不同色譜檢測技術的優(yōu)缺點Table 1 The advantages and disadvantages of different chromatography detection methods

GC/MS 分離效能高、選擇性強、靈敏度高、定性和定量能力強樣品需要氣化，應用范圍有限制、樣品前處理要求高、設備昂貴。[12]

3 牛奶中激素殘留色譜檢測方法的研究現(xiàn)狀

目前有殘留限量的激素類藥物種類，按照其種類可分為皮質(zhì)激素、孕激素、雄激素、雌激素和β－受體激動劑。而牛奶中五類激素殘留濃度極低，所以牛奶中激素類藥物殘留的檢測屬復雜基質(zhì)中痕量組分的分析。牛奶中激素類藥物殘留的檢測方法主要分為免疫分析法和色譜質(zhì)譜分析法。免疫分析法是單一測定方法僅能測定幾種特定的激素類藥物[15]，色譜法可以進行多組分分析。所以近年來，色譜法已被廣泛應用，逐步取代了單一的測定方法[16]。近幾年國內(nèi)外學者應用液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術對牛奶中這五類激素類藥物的檢測進行了深入研究，檢測技術不斷得到發(fā)展和進步。

3.1 皮質(zhì)激素

皮質(zhì)激素臨床主要用于升高血糖降低血酮以刺激奶牛的食欲，誘導分娩和抗炎；常用藥物有倍他米松、地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍等。崔曉亮等采用超高效液相色譜——串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜在多反應監(jiān)測模式下測定了牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留。樣品經(jīng)提取、濃縮和凈化處理得測試樣品，以Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18為色譜柱，以甲醇和含 0.1%甲酸的水為流動相進行梯度洗脫。方法的檢出限為0.02～0.38μg/kg，最低定量限為0.07～1.27μg/kg；添加水平為2μg/kg和0.4μg/kg時，12種糖皮質(zhì)激素的加標回收率為69.3%～94.3%，相對標準偏差為3.5%～16.7%[17]。馬育松等采用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中地塞米松殘留量。樣品用乙腈提取，C18 固相萃取柱凈化，得測試樣品，采用基質(zhì)匹配外標曲線法定量。在 2.0～400ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好線性，方法的測定低限：牛奶為 0.2μg/kg，奶粉為 1.0μg/kg。牛奶樣品在添加濃度為0.2～10μg/kg的范圍內(nèi)，回收率為 70.0%～110.0%；奶粉樣品在添加濃度為1.0-10μg/kg的范圍內(nèi)，回收率為 65.0%～100.0%，相對標準偏差在 8.65%～12.8%之間[18]。

3.2 孕激素

孕激素臨床主要用于先兆流產(chǎn)和習慣性流產(chǎn)、功能性子宮出血、子宮內(nèi)膜異位癥、避孕等[19]。常用藥物包括黃體酮、甲羥孕酮、甲地孕酮等。陳曉紅等建立牛奶中21а-羥基孕酮、17а-羥基孕酮、炔孕酮、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮和孕酮8種孕激素殘留的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)提取、凈化，在 Shim-pack XR-ODSⅡ快速柱上，以內(nèi)含0.1% (V/V)甲酸和5mmol/L乙酸銨的乙腈/水溶液進行梯度洗脫分離，采用正離子模式多反應監(jiān)測模式測定。各待測物在0.5～50.0μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性，回收率為 73.0% - 97.5%，相對標準偏差在 3.8%～8.6%之間，最低定量檢出限為0.1μg/kg～ 0.5μg/kg。方法簡便、快速、干擾少、特異性強，適合于牛奶中痕量孕激素殘留的檢測[20]。

3.3 雄激素

雄激素臨床主要用于睪丸功能不全、功能性子宮出血、子宮肌瘤、卵巢癌、再生障礙性貧血及老畜骨質(zhì)疏松癥等[19]。常用藥物包括睪酮、甲基睪酮、和同化雄激素苯丙酸諾龍等。呂惠卿等采用固相萃取——液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了牛奶中睪酮、孕酮、諾龍、甲基睪酮、勃地龍、群勃龍、美雄酮、康力龍 8 種同化激素殘留量的快速測定方法。樣品采用叔丁基甲醚提取，通過 C18固相萃取柱凈化，氮吹至干，殘留物用甲醇—水(10:90，V/V)溶解后測定。采用 MRM 模式進行定性定量分析。該方法的檢出限為 0.2～0.5μg/L，定量限為 0.5～1.0μg/L；在 2.0～200.0μg/L 范圍內(nèi)線性關系良好；在 1.0 ～5.0μ g/L 的添加水平上，8 種激素的平均回收率在 59.1%～97.7% 之間，相對標準偏差為 3.2%～11.9%[21]。

3.4 雌激素

雌激素臨床主要用于卵巢功能不全和促進發(fā)情、功能性子宮出血、退乳及乳房腫痛及老畜的骨質(zhì)疏松癥的治療等[22]。常用藥物包括β－雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、己烷雌酚等。薛敏等以β-雌二醇和炔雌醇的分子印跡聚合物為填料制備固相萃取小柱，對牛奶中雌激素進行富集，應用高效液相色譜法，建立了基于分子印跡固相萃取技術檢測牛奶中雌激素的新方法，檢出限低于 0.1mg/L，回收率高于 80%[23]。周建科等建立了牛奶中5種雌性激素( 雌三醇、雌二醇、炔諾酮、雌酮、己烯雌酚) 同時測定的高效液相色譜法。樣品經(jīng)脫蛋白和濃縮后得測定樣品，采用反相高效液相色譜法，以乙腈- 水(1︰1，V/V) 為流動相，5種雌性激素分離效果良好，平均回收率范圍為67.0 %～95.5 %，方法檢出限為1.0-2.0μ g/L[24]。劉敏等建立了中空纖維液相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用(HP-LPME-HPLC)檢測牛奶中的雌二醇的含量。采用自制的中空纖維萃取裝置，用100μL正辛醇作為萃取溶劑，在600r/min攪拌速度下萃取1h，雌二醇的富集倍數(shù)可達200倍，最低檢出限0. 571 ng/ml[25]。劉勇軍等通過液液萃取和固相萃取提取、凈化牛奶中添加的雌三醇，衍生化后，經(jīng)氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用對衍生物檢測分析，檢出限為0.5μg/L， 衍生物的峰面積與樣品質(zhì)量濃度在1～1000μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，不同雌三醇的加標回收率在78.2%～86.7%之間[26]。

3.5 β－受體激動劑

β－受體激動劑是一組選擇性β 2－腎上腺素受體激動劑，常用藥物有克倫特羅，沙丁胺醇及其鹽、酯，西馬特羅及其鹽、酯及制劑。該類藥物內(nèi)服或注射均易被吸收，排泄速度快，用藥量5～15倍時會導致動物可食性組織蓄積大量藥物殘留，食用后會引起人體心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用。朱勇等建立了同時測定牛奶中克倫特羅、氯霉素和己烯雌酚殘留量的同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。牛奶樣品無需蛋白沉淀，直接經(jīng)HLB 小柱凈化及水和正己烷淋洗，由乙酸乙酯洗脫后進行分析。采用 Acquity UPLC BEH C18色譜柱進行分離，以乙酸銨溶液－乙腈作為流動相進行梯度洗脫，MRM 方式測定，同位素稀釋內(nèi)標法定量。克倫特羅、氯霉素和己烯雌酚在牛奶樣品中的檢出限分別為 0.009、0.007和 0.04ng/g。牛奶中 3 種藥物在 0. 05～0.10(克倫特羅)、0.30～0.60(氯霉素)、0.50～1.0ng/g(己烯雌酚)加標水平下的回收率為 94%～107%，相對標準偏差均小于 10%[27]。岳秀英等應用GC一MS測定牛奶中鹽酸克倫特羅。樣品經(jīng)提取、凈化和衍生化后，牛奶中其3個添加濃度水平(0.005、0.01和0.02μ g/mL)的回收率為70%～170%，相對標準偏差為20%(n=5)，最低檢出限為5ng/mL，滿足殘留分析的要求[28]。

4 展望

牛奶及其制品中激素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問題，準確、快速的檢測方法是控制和解決牛奶中激素殘留問題的根本途徑。色譜技術因具有分辨率高、靈敏度高、分析速度快、重復性好、檢測限低、選擇性強、定性和定量能力強等優(yōu)點而廣泛的應用于牛奶中激素類藥物殘留的檢測。同時檢測技術從單一激素殘留檢測發(fā)展到多種激素殘留的同時速測定。除了檢測技術的進一步發(fā)展，檢測樣品的前處理技術也得到關注并有一定的進步。因為有效的樣品前處理技術直接影響檢測結果的準確性。分子印跡、固相萃取及微分子印跡、固相微萃取等技術在樣品凈化和濃縮處理方面的應用提高了牛奶中激素殘留的檢測準確度，也進一步促進了色質(zhì)譜聯(lián)用法在牛奶中激素及其他危害物質(zhì)檢測中的應用。

對牛奶中激素類藥物殘留的檢測應本著準確、方便、快速的原則，在現(xiàn)有研究成果的基礎之上可朝以下幾方面發(fā)展 ：提高接口術的改進和完善、繼續(xù)加強與其他先進的前處理萃取技術的聯(lián)用研究、小型、微型色譜柱的開發(fā)、MS譜庫識別技術的發(fā)展、基質(zhì)效應的徹底解決，以上都是研究人員值得關注和發(fā)展的方向。相信隨著色譜技術的日益成熟，其必會在檢測牛奶中激素殘留方面發(fā)揮重要的作用。

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