復(fù)方海藻膳食纖維對糖尿病小鼠降血糖作用的研究

李耀冬，葉 靜，肖美添

（華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361021）

糖尿病以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)，具有較高的 致殘率，成為影響人類健康的主要疾病之一[1]。膳食纖維由Hipsley于1953年提出，在保持消化系統(tǒng)的正常功能上起著重要作用。膳食纖維可以有效控制糖尿病血糖水平，增加外周組織對胰島素敏感性，尤以可溶性膳食纖維的作用更加明顯。

江蘺膳食纖維是由海洋紅藻江蘺提取的一種水溶性膳食纖維，由D-半乳糖和3，6-L-脫水半乳糖通過β-1，4和α-1，3糖苷鍵交替連接而成的復(fù)合多糖[2]，相比其他來源膳食纖維含有更多的親水基團(tuán)，其可溶性膳食纖維含量達(dá)80%以上，屬高可溶性膳食纖維。江蘺膳食纖維可于腸道內(nèi)形成水凝膠，延緩食糜進(jìn)入十二指腸，減慢糖的吸收速率[3]。

江蘺膳食纖維能夠降低糖尿病模型動物血糖，改善糖耐量并提高機(jī)體的抗氧化能力[4-6]。中藥成分黃酮、多糖能夠有效降低血糖，改善葡萄糖耐量（OGTT），促進(jìn)胰島素合成與分泌[7-11]。海藻酸鈉是由β-古洛糖醛酸和β-甘露糖醛酸以α-1，4和β-1，4糖苷鍵連接且具有多種生物活性的多糖可溶性鹽，廣泛用作食品添加劑。研究表明，海藻酸鈉具有降血糖作用，且可改善糖耐量，控制體重下降[12-13]。

目前，國內(nèi)外針對膳食纖維的研究較多，但未見海藻膳食纖維與中藥復(fù)配物降血糖作用的報道。本工作以江蘺膳食纖維為主要成分，海藻酸鈉為助劑，以桑葉、葛根、黃芪提取物為輔料，通過構(gòu)建糖尿病小鼠模型，研究復(fù)方海藻膳食纖維對糖尿病小鼠的降血糖作用，為海藻膳食纖維的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物 清潔級昆明種小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～20g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號為SCXK（滬）2012-0002；四氧嘧啶 Sigma；鹽酸二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；江蘺膳食纖維 福建金燕海洋生物科技股份有限公司；海藻酸鈉 明月海藻集團(tuán)；葛根、黃芪、桑葉 亳州市中藥飲片廠；其余 均為分析純。

TE313S-DS電子天平 德國賽多利科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計 上海美諾達(dá)儀器有限公司；L-550離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI有限公司；FD-1B-80冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；葡萄糖測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒 北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥材提取實驗 葛根100g，添加70%乙醇水溶液1.0L，80℃水浴加熱回流提取1h，3次，提取液合并過濾；桑葉100g，添加70%乙醇水溶液1.0L，80℃水浴加熱回流提取1h，3次，提取液合并過濾；黃芪100g，添加蒸餾水1.0L，水浴加熱回流提取1h，2次，提取液合并過濾。提取液濃縮，浸膏-70℃預(yù)凍24h，冷凍干燥48h[11-16]。

1.2.2 糖尿病模型制備與分組 健康雄性昆明種小鼠120只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，體重20～22g。禁食不禁水12h，經(jīng)尾靜脈注射（i.v.）以冰生理鹽水新鮮配制的四氧嘧啶（60mg/kg，0.1mL/10g）。5h后，灌胃50%葡萄糖溶液（0.3mL/10g），防止小鼠因血糖濃度過低死亡，自由進(jìn)食、飲水。5d后禁食不禁水12h，眼眶內(nèi)靜脈取血測定血糖。選取血糖濃度為16～25mmol/L的糖尿病小鼠，按空腹血糖水平隨機(jī)分為5組，高劑量組（HFP）、中劑量組（MFP）、低劑量組（LFP）、陽性對照組（POC）與模型對照組（MOC），每組10只。另選取10只血糖正常（3～6.1mmol/L）小鼠設(shè)為空白對照組（BLC）。

1.2.3 糖尿病小鼠降血糖實驗 高、中、低劑量組小鼠，每天分別灌胃高、中、低劑量的復(fù)方海藻膳食纖維（高劑量復(fù)配物：江蘺膳食纖維400mg/kg，海藻酸鈉240mg/kg，葛根提取物100mg/kg，桑葉提取物140mg/kg，黃芪提取物186mg/kg；中劑量復(fù)配物：江蘺膳食纖維200mg/kg，海藻酸鈉120mg/kg，葛根提取物50mg/kg，桑葉提取物70mg/kg，黃芪提取物93mg/kg；低劑量復(fù)配物：江蘺膳食纖維100mg/kg，海藻酸鈉60mg/kg，葛根提取物25mg/kg，桑葉提取物35mg/kg，黃芪提取物46mg/kg）0.1mL/10g。陽性對照組灌胃200mg/kg鹽酸二甲雙胍（0.1mL/10g），空白對照組與模型對照組灌胃等劑量生理鹽水（0.1mL/10g）。

1.2.3.1 指標(biāo)的測定 正常進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)30d后稱量每組小鼠體重。禁食12h，眼眶內(nèi)靜脈取血，采用試劑盒分別測定空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、甘油三酯（TG）。

1.2.3.2 口服葡萄糖耐量（OGTT）的測定 禁食12h，各劑量組給予不同濃度海藻膳食纖維復(fù)配物，陽性對照組灌胃鹽酸二甲雙胍，模型對照組、空白對照組給予等劑量蒸餾水。20min后灌胃葡萄糖（2.0g/kg），測定0、30、60、120min血糖[17]，葡萄糖耐量曲線下積分面積（AUC）計算方法為：0.25×（0min血糖濃度+4× 30min血糖濃度+3×120min血糖濃度）[18]。

1.2.3.3 胰腺組織結(jié)構(gòu)的測定 手術(shù)摘取各組小鼠胰腺，固定于10%福爾馬林溶液，用于制作HE染色切片[19]，光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行方差分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，差異顯著性p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同劑量復(fù)配物對小鼠空腹血糖（FBG）以及體重的影響

葡萄糖是胰島β細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑，同時也是胰島素釋放的主要引發(fā)劑和增強(qiáng)劑[20]。糖尿病患者血糖水平明顯升高，長期高血糖不僅會對胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能造成損傷，而且與慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展明顯相關(guān)。長期高血糖會導(dǎo)致細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2（GLUT-2）數(shù)量減少，使胰島素釋放機(jī)制中關(guān)鍵成分磷酸化程度減弱，最終導(dǎo)致胰島素釋放減少[21]。長期高血糖也使胰島β細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝發(fā)生障礙，氧化應(yīng)激水平增高，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡增加[22-23]，進(jìn)一步加強(qiáng)高血糖毒性作用。不同劑量海藻膳食纖維復(fù)配物對空腹血糖（FBG）以及體重的影響如表1所示。

表1顯示，實驗前，與空白對照組小鼠相比，各組小鼠體重?zé)o顯著性差異。各實驗組小鼠血糖濃度與空白對照組小鼠相比，差異極顯著，高、中、低劑量復(fù)配物組、陽性對照組、模型對照組間無顯著差異，表明小鼠糖尿病造模成功。

實驗后，與模型對照組小鼠體重相比，高劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組體重增加明顯，差異極顯著；陽性對照組與中劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組體重增加，差異顯著；低劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組體重與模型對照組無顯著性差異。說明海藻膳食纖維復(fù)配物能夠有效改善糖尿病小鼠體重減少的癥狀，且效果存在劑量依賴關(guān)系。與模型對照組空腹血糖濃度相比，高、中劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組、陽性對照組空腹血糖濃度下降，差異極顯著；低劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組空腹血糖濃度下降明顯，差異顯著。

以上說明海藻膳食纖維復(fù)配物能夠緩和糖尿病小鼠因糖代謝紊亂引起的體重減少癥狀，且可有效地控制糖尿病小鼠空腹血糖水平。降低高血糖對胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損害程度，延緩慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

表1 不同劑量復(fù)配物對空腹血糖（FBG）以及體重的影響（±s）Table 1 The effects of different dose of compounds on the fasting blood glucose（FBG）and body weigh（±s）

表1 不同劑量復(fù)配物對空腹血糖（FBG）以及體重的影響（±s）Table 1 The effects of different dose of compounds on the fasting blood glucose（FBG）and body weigh（±s）

注：*：與模型對照組相比，差異顯著（p<0.05）；**：與模型對照組相比，差異極顯著（p<0.01），Δ：與空白對照組相比，差異極顯著（p<0.01）；表2、表3同。

組別 數(shù)量 體重（g） FBG（mmol/L）實驗前 實驗后 實驗前 實驗后HFP 10 21.34±1.21 32.07±3.42** 19.95±2.94Δ 15.82±3.50** MFP 10 21.19±1.05 30.73±6.02* 19.93±3.00Δ 14.79±4.80** LFP 10 21.53±1.41 28.10±3.38 19.99±3.06Δ 18.29±3.46* POC 10 21.45±1.33 31.03±6.00* 19.99±3.02Δ 10.37±1.60** MOC 10 21.12±1.07 25.08±2.27 19.88±3.05Δ 21.52±2.55 BLC 10 21.15±1.32 43.66±1.84** 4.52±0.74 4.65±0.57

2.2 不同劑量復(fù)配物對小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）的影響

糖尿病模型小鼠葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)受損以及胰島素敏感性降低，口服葡萄糖耐量測試（OGTT）可以表征胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對血糖的調(diào)節(jié)能力以及高血糖對葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)損害的大小，結(jié)果如圖1所示。葡萄糖耐量曲線下積分面積見表2。

圖1 各組小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）曲線Fig.1 Oral glucose tolerance（OGTT）curves of different group mice

圖1可以看出，空白對照組小鼠血糖濃度于實驗開始后30min達(dá)到最大值，并在120min內(nèi)，血糖濃度恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。模型對照組小鼠在30～60min內(nèi)，血糖濃度升至最高并保持穩(wěn)定，120min時未有顯著下降，表明糖尿病模型小鼠胰島素分泌延遲，胰島β細(xì)胞功能受損、機(jī)體對血糖的調(diào)節(jié)能力下降，葡萄糖耐量受損嚴(yán)重，葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂。與模型對照組小鼠相比，陽性對照組葡萄糖耐量得到顯著改善，高、中劑量復(fù)配物灌胃組葡萄糖耐量得到改善，并以中劑量復(fù)配物效果較佳。

表2 各組小鼠葡萄糖耐量曲線下積分面積（±s）Table 2 Integral area of each group mice under glucose tolerance curve（±s）

表2 各組小鼠葡萄糖耐量曲線下積分面積（±s）Table 2 Integral area of each group mice under glucose tolerance curve（±s）

組別 數(shù)量 AUC HFP 10 57.07±9.60 MFP 10 52.45±8.92* LFP 10 60.92±5.38 POC 10 42.03±10.04** MOC 10 61.02±6.83 BLC 10 20.16±1.73

表2顯示，陽性對照組AUC與模型對照組小鼠相比明顯減小，差異極顯著；中劑量海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃組AUC與模型對照組小鼠相比減小，差異顯著。說明中劑量海藻膳食纖維復(fù)配物能夠有效減慢葡萄糖的吸收速率，減輕胰島負(fù)擔(dān)，從而改善糖尿病模型小鼠葡萄糖耐量受損，改善葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

2.3 不同劑量復(fù)配物對小鼠血脂的影響

Ⅰ型糖尿病以胰島素分泌絕對不足為主要特征，四氧嘧啶特異性地破壞胰島β細(xì)胞，造成胰島素合成、分泌不足。胰島素合成、分泌缺陷導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分解，增高血脂水平并加重肝臟負(fù)擔(dān)[24]。合理控制血脂水平可以減少對胰島β細(xì)胞的損傷，海藻膳食纖維復(fù)配物對小鼠血脂水平的影響，見表3。

表3顯示，與模型對照組小鼠相比：海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃各組TC無顯著差異；高劑量復(fù)配物灌胃組HDL-C差異極顯著，中劑量復(fù)配物灌胃組HDLC差異顯著，低劑量復(fù)配物灌胃組HDL-C差異不顯著；高劑量復(fù)配物灌胃組LDL-C差異顯著，中、低劑量復(fù)配物灌胃組LDL-C差異無顯著性；高、中劑量復(fù)配物灌胃組TG差異顯著，低劑量復(fù)配物灌胃組TG差異不顯著；陽性對照組，LDL-C差異不顯著，TC、HDLC差異顯著，TG差異極顯著；空白對照組LDL-C、TC、 TG、HDL-C差異極顯著。

表3 不同劑量復(fù)配物對小鼠血脂的影響（±s）Table 3 Effect of different doses of compound on serum lipid profiles of mice（±s）

表3 不同劑量復(fù)配物對小鼠血脂的影響（±s）Table 3 Effect of different doses of compound on serum lipid profiles of mice（±s）

組別 數(shù)量 TC（mmol/L） HDL-C（mmol/L） LDL-C（mmol/L） TG（mmol/L）HFP 10 5.74±0.58 2.56±0.24** 2.71±0.34* 1.39±0.31* MFP 10 6.01±0.67 2.51±0.36* 3.02±0.36 1.43±0.28* LFP 10 6.20±0.91 2.24±0.44 3.10±0.59 1.62±0.45 POC 10 5.59±0.44* 2.53±0.33* 2.80±0.52 1.22±0.27** MOC 10 6.31±0.63 2.21±0.18 3.21±0.42 1.64±0.34 BLC 10 5.06±0.53** 2.65±0.14** 2.56±0.40** 1.03±0.39**

表3說明糖尿病模型小鼠血糖升高的同時，伴發(fā)嚴(yán)重的脂質(zhì)異常代謝。鹽酸二甲雙胍可抑制游離脂肪酸從脂肪細(xì)胞中釋出，而脂肪酸可能對胰島β細(xì)胞的功能具有損害作用[18]；鹽酸二甲雙胍通過降低脂質(zhì)過氧化水平，減少對胰島β細(xì)胞的損傷程度，并提高外周組織胰島素敏感性[25]。高、中劑量復(fù)配物能夠有效地降低糖尿病模型小鼠的血脂異常代謝水平。血脂水平與血糖的高低有著緊密的聯(lián)系，特別是血糖水平直接影響TG水平的高低[26]。胰島素可以通過激活脂蛋白脂肪酶（LPL）增加HDL-C的合成，且可促進(jìn)受體載脂蛋白B（Apo-B）介導(dǎo)的LDL-C的分解作用，因此胰島素分泌不足往往是導(dǎo)致糖尿病脂質(zhì)代謝異常的主要原因[27-28]。海藻膳食纖維復(fù)配物可以降低血脂水平，減少脂質(zhì)過氧化作用對胰島β細(xì)胞的損害程度，促進(jìn)胰島素合成與分泌，起到降血糖作用。

2.4 胰腺組織HE染色

由于胰島β細(xì)胞被特異性破壞，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胰腺組織經(jīng)HE染色之后，顯微鏡下觀察，可見“蘭氏小島”（islet of Langerhans）染色區(qū)域變小、邊緣不規(guī)則、細(xì)胞核萎縮等。各組小鼠胰腺組織切片HE染色，顯微鏡檢查，結(jié)果如圖2所示。

圖2 小鼠胰腺組織學(xué)染色結(jié)果（200×）Fig.2 Results of histologically-stained islet in pancreas（200×）

光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對照組胰腺組織經(jīng)HE染色，“蘭氏小島”（islet of Langerhans）邊緣規(guī)則、完整，區(qū)域大小正常呈圓形或橢圓形，β細(xì)胞以及胞質(zhì)內(nèi)胰島素分泌顆粒多，染色程度深。模型對照組胰島β細(xì)胞以及胞質(zhì)內(nèi)胰島素分泌顆粒嚴(yán)重減少，染色程度淺，“蘭氏小島”染色區(qū)域很小，邊緣不規(guī)則。與模型對照組相比，海藻膳食纖維復(fù)配物灌胃各組、陽性對照組小鼠“蘭氏小島”染色區(qū)域明顯增大，邊緣較規(guī)則，特別是高、中劑量復(fù)配物灌胃組與陽性對照組β細(xì)胞增多，胞質(zhì)內(nèi)胰島素分泌顆粒增加，染色程度較深。

HE染色結(jié)果表明，復(fù)方海藻膳食纖維可以降低四氧嘧啶對胰島β細(xì)胞的損傷程度，修復(fù)胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而增加胰島素合成與分泌。

3 結(jié)論

本實驗以四氧嘧啶致糖尿病小鼠，對海藻膳食纖維復(fù)配物的降血糖效果進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果表明，海藻膳食纖維復(fù)配物能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖，減輕高血糖對機(jī)體的毒害作用；改善糖尿病小鼠葡萄糖耐量并緩解“三多一少”癥狀。其降血糖機(jī)制可能與復(fù)方海藻膳食纖維改善脂質(zhì)異常代謝，促進(jìn)胰島β細(xì)胞修復(fù)與再生有關(guān)。

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