雌性榧樹4個居群遺傳多樣的SRAP分析

劉浩凱，胡樹恒 ，董雷鳴，張 輝，曾燕如，喻衛(wèi)武，戴文圣

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；2.浙江省臨安市森林資源保護管理總站，浙江 臨安 311300）

榧樹Torreya grandisFort. ex Lindl.隸屬于紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya，雌雄異株，為第三紀孑遺植物，分布于江蘇南部、浙江、福建北部、江西北部、安徽南部，南至湖南西南部及貴州松桃等[1]中亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)[2]。香榧T.grandis‘Merrilli’是榧樹的一個優(yōu)良自然變異類型經(jīng)無性繁殖培育而成的栽培類型，也是迄今為止榧樹這個種乃至榧屬中唯一一個商品化生產(chǎn)的栽培類型，其生產(chǎn)上的授粉樹是雄性榧樹。

由于香榧具有很高的經(jīng)濟價值，相關(guān)的研究報道較多。隨著對榧樹資源認識的加深及分子標記技術(shù)的發(fā)展，研究人員先后采用AFLP（擴增片段長度多態(tài)）[3-5]、ISSR（簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增）[5-7]、RAPD（隨機擴增多態(tài)DNA）[8-9]標記對包括香榧在內(nèi)的榧樹開展了研究，但所有這些標記均為顯性標記，至今尚無適用于榧樹群體遺傳研究的共顯性標記的報道。沈登鋒率先建立了適用于榧樹的SRAP（序列相關(guān)擴增多態(tài)性）標記分析體系，并利用該標記對榧樹的種質(zhì)資源及生長快速的野生榧樹種質(zhì)開展了研究[7]。在這些標記中，相比AFLP操作的復(fù)雜性，RAPD、ISSR、SRAP標記的操作要簡單得多，但SRAP不同于RAPD、ISSR標記，可顯示大量的共顯性[10-11]。

香榧的存在已有千年，在長期無性繁殖過程中不可避免地出現(xiàn)了分化。因此，品種改良和創(chuàng)新勢在必行，而品種改良和創(chuàng)新均必須以豐富的種質(zhì)資源為基礎(chǔ)。此外，實生榧樹種內(nèi)性狀變異極其復(fù)雜，豐富的基因資源是創(chuàng)新品種的遺傳基礎(chǔ)。因此，在分子水平上研究雌性榧樹的遺傳多樣性具有重要的選育種價值?；赟RAP標記的雌性榧樹遺傳多樣性研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為榧樹的嫩葉，采自榧樹主要分布區(qū)安徽省黃山市小榮村（29個樣品）和樵山村（24個樣品），浙江省淳安縣臨岐鎮(zhèn)朱塔村（22個樣品），臨安市太湖源村（11個樣品）的天然榧樹群體（見圖1），樣株之間彼此至少相距100 m，共86個雌株樣品。榧樹嫩葉采集后放入帶有硅膠的自封袋中，帶回實驗室后置于－40 ℃冰箱貯存，用于后續(xù)基因組DNA的提取。

圖1 4個雌性榧樹居群的地理位置Fig. 1 Geographic distribution of 4 populations of T. grandis

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

在DNA提取過程中，樣品的研磨采用冷凍混合球磨儀（MM400，德國Retsch），震動頻率設(shè)置為30 Hz，震動研磨時間設(shè)置為40 s。樣品研磨后參照沈登鋒的改良CTAB法提取榧樹嫩葉DNA[7]，提取的DNA用分光光度計（NanoDrop，ND-100） 測 定 DNA濃 度、OD260值、OD280值及其比值，并用1%瓊脂糖凝膠150 V電泳，電泳結(jié)果在AlphaImager成像系統(tǒng)（Alpha Innotech Corporation, USA）中拍照貯存。

1.2.2 SRAP-PCR擴增

SRAP-PCR擴增體系及程序在沈登鋒建立的SRAP反應(yīng)分析體系[7]基礎(chǔ)上進行改進，改進后的反應(yīng)體系為：模板DNA（10 ng·μL－1）2 μL，MgCl2（25 mmol·L－1）1.76 μL，Taq 酶（5 U·μL－1，上海申能博彩生物科技有限公司）0.2 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各 0.4 μL，dNTPs（10 mmol·L－1，生工生物工程 (上海 )股份有限公司）0.72 μL，10×PCR buffer 2 μL，ddH2O 12.52 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；共5個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；隨后35個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保持。

在本試驗中，PCR擴增產(chǎn)物的電泳摒棄了原瓊脂糖凝膠電泳的方法，采用8%[Acr（丙烯酰胺）︰Bis（甲叉丙烯酰胺）＝29︰1]非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE），在180 V恒定電壓下，于DYCZ-30C電泳儀（北京市六一儀器廠）中電泳70 min，然后進行銀染、拍照。參照郭大龍等的方法[12]，電泳膠的銀染僅采用了銀染及顯影步驟，同時銀染液（0.15% AgNO3＋10%乙醇）未采用甲醛，而采用乙醇；顯影液（20% NaOH＋0.4%甲醛）中用強堿（200 g·L－1NaOH）取代了Na2CO3溶液，省去了固定和定影2個步驟。

1.2.3 引物篩選

Li和Quiros[11]報道了SRAP 10對正向引物及10對反向引物共100對引物組合?；诖耍缮ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰竞铣梢?，并用4個榧樹基因組DNA進行篩選，最后用經(jīng)過篩選的引物對樣品進行分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

樣品DNA SRAP分析結(jié)果中有擴增位點的讀成1，反之讀成0，形成0/1原始矩陣。參考Smith[13]等的方法計算多態(tài)信息含量（PIC）值。應(yīng)用POPGENE Version 1.31軟件[14]，在假定種群處于哈迪-溫伯格平衡前提下，對標記數(shù)據(jù)進行遺傳參數(shù)分析。應(yīng)用AMOVA（Analysis of Molecular Variance）1.55[15]進行分子方差分析，計算遺傳變異在居群間和居群內(nèi)的分布。對居群遺傳距離與地理距離的相關(guān)性進行Mantel檢驗[16]。運用NTSYS 2.1軟件，基于Nei’s遺傳一致度，對4個雌性榧樹居群進行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

使用冷凍混合球磨儀研磨樣品的效率較高，提取的基因組DNA與手工研磨的效果相當，2個波長的光密度比值OD260/OD280可達到1.8～2.0，且瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果顯示提取的DNA條帶明亮，可用于后續(xù)的標記分析。

2.2 SRAP-PCR擴增的多態(tài)性

SRAP引物經(jīng)篩選，有26對引物組合F1R9、F2R1、F2R6、F2R10、F3R1、F3R9、F4R9 、F5R4、F5R5、F5R9、F5R10、F6R2、F6R4、F6R8、F7R2、F7R9、F7R10、F8R1、F9R2、F9R3、F9R4、F9R5、F10R2、F10R4、F10R6、F10R7能夠擴增出清晰、多態(tài)且可重復(fù)的條帶，用于研究樣品的SRAP分析。結(jié)果共擴增產(chǎn)生了404個位點，其中多態(tài)位點330個，平均每對引物擴增出了12.69個多態(tài)位點，多態(tài)性位點的比率（PPL）為83.79%；擴增位點數(shù)最多的引物組合是F10R7，擴增出了20個位點；擴增位點數(shù)最少的引物組合是F6R4、F7R10和F10R2，擴增位點數(shù)均為8個（見圖2和表1）。26對引物組合的平均多態(tài)信息含量（PIC）值為0.294 3，F(xiàn)7R2具有最高的PIC值（0.410 7），F(xiàn)9R3具有最低的PIC值（0.215 9）。

表1 SRAP引物組合及擴增結(jié)果Table 1 Primer pairs of SRAP and amplification result

圖2 引物對F5R5擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 2 Electrophoresis result of sample DNAs amplified with F5R5 primer pair

2.3 雌性榧樹居群的遺傳多樣性

Popgene 32分析結(jié)果表明，雌性榧樹在物種水平上，多態(tài)位點的比率（PPL）為81.68%。觀察的等位基因數(shù)（Na）為2，有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.484 6，Nei’s基因多樣性（H）為 0.294 9，Shannon信息指數(shù)（I）高于H，為0.454 5（見表2），物種內(nèi)多樣性較豐富。由H估算的雌性榧樹總遺傳多樣性（Ht）為0.288 0。

在居群水平上，各居群間PPL存在著較大的差異，其中小榮居群最高，為93.64%，其次是樵山和朱塔居群，分別為92.42%、91.52%，最低的是太湖源居群，為57.58%，平均83.79%，略高于物種水平，而Na、Ne、H、I均略低于物種水平（見表2）。4個雌性榧樹居群總的基因多樣度（Ht）為0.288 0，居群內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.256 6。各居群Nei’s基因多樣性（H）在0.182 0～0.290 8之間；Shannon（I）指數(shù)在0.277 3～0.441 8之間，各居群的Shannon信息指數(shù)與Nei’s基因多樣性指數(shù)變化趨勢基本一致，但也是I高于H。以多樣性指數(shù)為評價指標，則樵山居群的遺傳多樣性最高（H＝0.290 8，I＝0.441 8），太湖源居群遺傳多樣性最低（H＝0.182 0，I＝0.277 3）（見表2）。

表2 雌性榧樹物種水平及各居群內(nèi)的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity in female T. grandis at population and species levels

2.4 雌性榧樹居群的遺傳變異來源

Popgene 32分析結(jié)果表明，居群間基因分化系數(shù)（Gst）為0.108 9，表明大多數(shù)遺傳變異存在于居群內(nèi)，即變異居群內(nèi)占89.11%，而居群間僅占10.89%。通過Gst計算出的居群間的基因流Nm[Nm＝0.5(1－Gst)/Gst]為4.090 9，表明居群間每代進行有效基因交流數(shù)為4個左右，低于異交、風(fēng)媒植物基因流的平均水平（Nm＝5.380）[17]。盡管雌性榧樹居群內(nèi)遺傳多樣性大于居群間，但居群間存在基因流。

AMOVA方差分析結(jié)果表明（見表3），雌性榧樹居群總的遺傳變異中，居群間占8.01%，91.99%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，結(jié)果與Popgene 32的分析結(jié)果接近，也說明雌性榧樹居群內(nèi)的變異遠大于居群間，即遺傳變異主要分布在居群內(nèi)。

表3 雌性榧樹居群SRAP分子標記位點頻率的方差分析（AMOVA）?Table 3 AMOVA of locus frequency expressed by SRAP molecular markers for four populations in female T. grandis

2.5 雌性榧樹居群間的遺傳距離及聚類分析

Popgene 32 分析結(jié)果（見表4）表明，4個雌性榧樹居群兩兩間的Nei’s遺傳相似性在0.922 5～0.974 7之間，平均為0.953 7；遺傳距離（D）的變化范圍為0.025 6～0.080 6，平均遺傳距離為0.047 6。用Mantel的方法來檢測遺傳距離與地理距離之間的關(guān)系，結(jié)果表明基于SRAP的遺傳距離和地理距離之間的相關(guān)性不顯著（r＝0.683 7，p＝1.000 0）。

根據(jù)Popgene 32分析的雌性榧樹居群間的Nei’s遺傳一致度，對4個雌性榧樹居群進行UPGMA聚類（見圖3）。結(jié)果表明小榮和朱塔2個居群的遺傳距離最?。―＝0.025 6），遺傳相似度最高（0.974 7），先聚在一起，然后再與樵山居群聚在一起，最后與太湖源居群聚集在一起。總的來說，4個居群彼此之間的遺傳距離相差不大。

表4 雌性榧樹4個居群的遺傳相似性和遺傳距離?Table 4 Nei’s genetic identities and genetic distances between four populations in female T. grandis

圖3 雌性榧樹4個居群遺傳關(guān)系的UPGMA聚類Fig. 3 UPGMA Phylogenetic clustering of four populations in female T. grandis

3 結(jié)論與討論

SRAP標記是基于其它DNA分子標記技術(shù)的優(yōu)缺點上發(fā)展起來的新的分子標記技術(shù)[18]。它根據(jù)基因外顯子里GC堿基含量豐富和內(nèi)含子、啟動子里AT堿基含量豐富來設(shè)計引物進行DNA擴增，其應(yīng)用前景廣泛，但在應(yīng)用上的體系優(yōu)化不容忽視[19-21]。本研究中利用SRAP分子標記技術(shù)對4個天然雌性榧樹居群的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析，結(jié)果顯示，榧樹在物種水平和居群水平上的遺傳多樣性均較高，且雌性榧樹居群的遺傳多樣性主要存在于居群內(nèi)（91.99%），居群內(nèi)的遺傳差變異明顯大于居群間，與Hamrick[17]等對異交風(fēng)媒植物的研究結(jié)果類似。

基因流是影響居群內(nèi)部和居群間遺傳變異程度的重要因素[22]。遺傳結(jié)構(gòu)是通過物種居群內(nèi)和居群間遺傳分化來體現(xiàn)的，基因流的大小也可以反映居群遺傳結(jié)構(gòu)變異的大小。一般來說，基因流大的物種，居群間遺傳分化小[23]，反之，居群間的遺傳分化大[24]。Wrigh[25]認為，當Nm＞1時，說明居群間存在一定的基因流動。本研究中雌性榧樹Nm＝4.090 9＞1，從一個側(cè)面反映了榧樹居群間遺傳分化較小的原因，這與榧樹風(fēng)媒傳粉的特性相符。4個居群UPGMA聚類的結(jié)果也證實了這一點。此外，雌性榧樹地理分布所產(chǎn)生的地理隔離對遺傳分化沒有顯著的影響，不是決定雌性榧樹居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素，不符合“距離決定隔離”模式[26]。

Shannon信息指數(shù)（I）是一個常用的描述多樣性的參數(shù)，一般大于0.5時表明多樣性豐富。在本研究中，雌性榧樹物種水平的I值接近0.5，說明種內(nèi)多樣性豐富，這與該物種雌雄異株異交的特性有關(guān)。豐富的多樣性一方面使得該物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力增強，另一方面，豐富的變異確實使該物種在物種內(nèi)具有選擇種實性狀接近或優(yōu)于香榧種質(zhì)的潛力[27]。浙江省已先后從天然榧樹群體中選育了12個新品種，并通過了省級認定。此外，太湖源居群因本身群體不大，因此取樣數(shù)較少，但不影響研究的進行。在銀杏Ginkgo biloba[28]、紫苜蓿Medicago sativa[29]、云南沙棘Hippophae rhamnoidessubsp. yunnanensis[30]等物種的群體遺傳研究中有類似的報道，但其4個基因遺傳參數(shù)（Na、Ne、H、I）與另3個居群相比較均偏低，是否與雄株有關(guān)還有待于結(jié)合雄性榧樹群體的遺傳多樣性開展進一步的研究，因為在大力發(fā)展香榧產(chǎn)業(yè)之前，許多地方的老百姓不了解榧樹的生物學(xué)特性，因雄性榧樹不結(jié)果而砍伐雄性榧樹用作薪碳材，以致于出現(xiàn)每年春天香榧授粉期榧樹花粉短缺的情況。

榧樹的種子目前主要用于香榧砧木苗的繁殖，但實際上其種子的營養(yǎng)成分變異十分豐富[31]，具有開發(fā)功能食品的潛力。隨著對榧樹經(jīng)濟價值認識的日益增加，對其的利用程度也會有所增加，目前浙江省正在進行向榧樹分布8省推廣香榧種植的工作。在這種情況下，各地更要注重天然榧樹資源及其多樣性的就地保護，并利用優(yōu)良雌雄株資源開展常規(guī)育種工作，豐富榧樹栽培的品種。

[1] 鄭萬鈞,傅立國.中國植物志:第7卷[M].北京:科學(xué)出版社,1978:459.

[2] 程曉建,黎章矩,喻衛(wèi)武,等.榧樹的資源分布與生態(tài)習(xí)性[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2007,24(4):383－388.

[3] 梁 丹,吳 勇,曾燕如,等.香榧AFLP實驗體系的建立[J].福建林業(yè)科技,2007,34(2):93－96.

[4] 梁 丹,周 秦,殳 燕,等.利用AFLP進行榧樹雌雄株鑒定的初步研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2009,26(1):63－67.

[5] 葉生月.香榧遺傳圖譜構(gòu)建和苗期生長相關(guān)QTL的定位[D].臨安:浙江林學(xué)院,2009.

[6] 戴 正,陳力耕,童品璋.香榧品種遺傳變異與品種鑒定的ISSR分析[J].園藝學(xué)報,2008,35(8):1125－1130.

[7] 沈登鋒.榧樹種質(zhì)資源的收集、評價與核心種質(zhì)的確定[D].臨安:浙江農(nóng)林大學(xué),2011.

[8] 戴 正,陳力耕,童品璋.香榧性別鑒定的RAPD和SCAR標記[J].果樹學(xué)報,2008,25(6):856－859.

[9] 胡芳名,張黨權(quán),烏云塔娜,等.香榧RAPD分析實驗條件的優(yōu)化[J].經(jīng)濟林研究,2002,20(3):5－7.

[10] 張 彤,屈淑平,崔崇士.SRAP標記在蔬菜作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(1):119－122.

[11] LI G, QUIROS C F. Sequence-related amplified polymerpgism(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:It’s application to mapping and gene tagging in Brassica [J].Theor Appl Genet, 2001, 103: 455－461.

[12] 郭大龍,張君玉,石春梅.一種簡便快速高效的DNA銀染方法[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,7(2):774－776.

[13] Smith J SC, Chin ECL, Shu H,et al.An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea maysL):Comparison with data from RFLPs and pedigree [J]. Theor Appl Genet,1997, 95: 163－173.

[14] Yeh F C, Boyle T J B. PoPgene version 1.31. Mierosoft windowbased freeware for Population analysis, AB[M]. Edmonton:University of Alberta and Centre for Intemational Forestry Research, 1999.

[15] Excoffier L, SmouseP E, Quattro JM. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes applications to human mitochondrial DNA restriction data [J].Genetics, 1992, 131: 479－491.

[16] Mantel N A. The detection of disease clustering and ageneralized regression approach [J]. Cancer Research, 1967, 27:209－220.

[17] Hamrick JL. Geneflow and distribution of genetic variation in plant populations[C]//Urbanska K. Differentiation patterns in higher plants. New York: Academic Press, 1987:53－67.

[18] 張黨權(quán), 田 華, 謝耀堅, 等. 桉樹4個種遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2010, 30(1):12－17.

[19] 祝全東, 張黨權(quán), 李曉云, 等. 油茶SRAP標記的PCR體系建立與優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2010, 30(3):57－62.

[20] 彭邵峰, 張黨權(quán), 陳永忠, 等. 14個油茶良種遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(1):80－85.

[21] 鄒明宏, 郭凌飛, 曾 輝, 等. 山竹子基因組DNA提取及SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 經(jīng)濟林研究, 2009, 27(3):38－41.

[22] Slatkin M. Gene flow and the geographic structure of natural populations[J]. Science, 1987, 236(4803): 787－792.

[23] Ellstrand N C, ElamDR. Population genetic consequences of population size: implications for plant conservation[J]. Annual Review of Ecology and Systematic, 1993, 24: 217－242.

[24] Rowe G, Beebee TJ C, Burke T. Phylogeography of the natterjack toadBufo calamitain Britain: genetic differentiation of native and translocated populations [J]. Mol Ecol, 1998, 7(6):751－760.

[25] Wirght S. The genetic structure of populations [J]. Ann Eugen,1951, 15: 323－354.

[26] Wright S. Isolation by distance[J]. Genetics, 1943, 28(2): 114－138.

[27] 沈登鋒,曾燕如,喻衛(wèi)武,等.榧樹種質(zhì)資源的收集與種子理化性質(zhì)的初步分析[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報,2011,28(5):747－752.

[28] 葛永奇,邱英雄,丁炳揚,等.孑遺植物銀杏群體遺傳多樣性的ISSR分析[J].生物多樣性,2003,11(4):276－287.

[29] Majid Talebi, Zahra Hajiahmadi, Mehdi Rahimmalek.Genetic Diversity and Population Structure of Four Iranian Alfalfa Populations Revealed by Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers[J]. J Crop Sci Biotech, 2011, 14(3): 173－178.

[30] 周道姍. 中國沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性研究[D].北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院,2005.

[31] 董雷鳴,曾燕如,鄔玉芬,等.榧樹天然群體中種子表形特征與化學(xué)成分的變異分析[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報,2014, 31(2):224－230.