重組雞β-防御素12蛋白的原核表達及其生物學(xué)特性分析

馬得瑩，徐 楊,，李妍妍,，徐倩倩,，張婷婷,，韓宗璽，劉勝旺

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽病研究室，哈爾濱 150001）

禽類是人畜共患病食源性細菌（如沙門氏菌和彎曲桿菌等）和病毒（如H5N1，H7N9等）的攜帶者，因此增強禽類機體免疫力是保證禽類健康和公共衛(wèi)生安全關(guān)鍵[1-2]。防御素為禽類先天性免疫重要組成部分。目前已發(fā)現(xiàn)的禽類防御素（Avianβ-defensins，AvBDs）均屬β-防御素亞類[3]。禽β-防御素為兩親性結(jié)構(gòu)的陽離子抗菌肽，含有位置保守的6個半胱氨酸殘基構(gòu)成的3對二硫鍵，多由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成[3-5]。雞β-防御素12則是由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成[6]。迄今為止，已從雞[7]、火雞[8]、鴨[9]和鵝[10]等禽類體內(nèi)分離到40余種禽β-防御素。禽β-防御素具有廣譜抗菌活性，能有效殺滅多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌[9-12]，對腫瘤細胞和某些被膜病毒有抑制作用[11,13]。此外，防御素可作為天然免疫信號誘導(dǎo)炎性細胞因子表達，激活TLR-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動、調(diào)節(jié)并放大獲得性免疫反應(yīng)，進一步增強機體免疫力[14]。因此，禽β-防御素是禽類抵御病原微生物入侵的重要屏障。

為探討禽β-防御素的生物學(xué)功能，采用基因工程方法在特定宿主內(nèi)大量表達禽β-防御素融合蛋白為有效途徑。目前，雞AvBD1[15]、AvBD5[16]、AvBD6[17]、AvBD10[18]等已實現(xiàn)在大腸桿菌中原核表達，純化后重組蛋白均具有體外抗菌活性。尚未見有關(guān)雞β-防御素12在防御系統(tǒng)作用等研究報道。本研究將雞β-防御素12基因成熟肽片段克隆至pProex HTa表達載體中，原核表達雞AvBD12重組蛋白，測定其體外生物學(xué)特性。此外，應(yīng)用熒光定量PCR法檢測該基因在組織臟器中分布，為進一步開展禽β-防御素研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

14日齡SPF雞，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗中心提供。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒

金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、兔波氏桿菌（ATCC 33222）、豬霍亂沙門氏菌（CVCC 2140）、乳酸菌（ATCC 33222）均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；克隆質(zhì)粒載體PMD18-T-Simple Vector購自寶生物工程（大連）有限公司，表達質(zhì)粒載體pProex HTa、克隆菌株E.coliTGⅠ及表達菌株E.coliBL21（DE）plysS均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室禽病研究室保存。

1.1.3 主要試劑

T4DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XholⅠ、IPTG購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取TRizol試劑盒購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；一步法RT-PCR試劑盒、Protein Refolding Kit蛋白純化試劑盒購自Novagen公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的雞AvBD12（NM-001001607）的cDNA基因序列和表達載體序列進行酶切位點分析，并應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計4對PCR引物，其中Q1/Q2為克隆引物，Q3/Q4為表達引物，Q5/Q6為AvBD12定量PCR引物，Q7/Q8為18S rRNA定量PCR引物。

Q1：5'ATGAGGAACCTTTGTTTCGTGT 3';

Q2：5'TCAGGTCTTGGTGGGAGTTG 3';

Q3：5'GAATTCATGGACAGCTGTAACCACG 3';

Q4：5'CTCGAGTCAGGTCTTGGTGGGAGTTG3';

Q5：5'GGAACCTTTGTTTCGTGTTCA 3';

Q6：5'GAGAATGACGGGTTCAAAGC 3';

Q7：5'GGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGG 3';

Q8：5'TGAGGTTTCCCGTGTTGAGTC 3'。

Q3的5'端含有EcoR I酶切位點；Q4的5'端含有Xho1 I酶切位點。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 基因克隆、測序及遺傳進化分析

取雞脾臟約0.1 g，按照TRIzolTM試劑盒提取總RNA，體系為20 μL。根據(jù)一步法RT-PCR試劑盒說明書擴增目的片段，體系中引物為克隆引物Q1和Q2。取2～3 μL擴增產(chǎn)物，利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定?；厥漳康钠闻cpMD18-TSimple載體連接（重組質(zhì)粒命名為pMD-AvBD12），轉(zhuǎn)化E.coliTGⅠ感受態(tài)細胞，篩選陽性質(zhì)粒，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將得到的雞AvBD12序列應(yīng)用DNAStar軟件中的MEGALIGN程序與已知的禽β-防御素基因及部分哺乳動物的β-防御素基因序列作同源性比較。

1.2.3 原核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組蛋白的表達及純化

以重組質(zhì)粒pMD-AvBD12為模板，采用表達引物Q3和Q4將AvBD12成熟肽段基因亞克隆到表達質(zhì)粒載體pProex HTa上，將構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pProex-AvBD12。鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達感受態(tài)細胞E.coliBL21（DE）plysS，利用質(zhì)粒PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆，陽性克隆由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

將鑒定為陽性的菌液少量活化后，以1∶100接到含有AMP+的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)。待OD600nm值達到0.5～0.6時，留取1 mL菌液作為對照，并在剩余菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG進行誘導(dǎo)蛋白表達，分別在誘導(dǎo)4和5 h后各留取1 mL菌樣。按照Novagen公司的蛋白純化復(fù)性試劑盒說明書進行包涵體的純化、復(fù)性和透析，并測定重組蛋白濃度。留取1 mL超聲波破碎離心的上清液和少量沉淀，將沉淀用100 μL PBS（pH 7.4）重新懸起。將誘導(dǎo)前對照菌樣、誘導(dǎo)后菌樣、上清液、沉淀樣和純化后的蛋白進行Tricine-SDSPAGE電泳分析，用薄層掃描儀觀察結(jié)果。

1.2.4 重組雞AvBD12蛋白抗菌活性測定

采用菌落計數(shù)方法測定重組雞AvBD12蛋白的抗菌活性。用pH 7.4的無菌PBS稀釋重組雞AvBD12蛋白與His標(biāo)簽非重組蛋白，使其終濃度分別為50、100、250 和500 μg · mL-1，各取250 μL加入無菌管中。將1.1.2所述各株細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋細菌至2×106cfu·mL-1，分別取每株細菌培養(yǎng)物10 μL至試管中，同時用PBS代替重組蛋白作為陰性對照，每組設(shè)置3個重復(fù)。37℃振蕩孵育4 h后，每個稀釋度各取200 μL接種在營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱孵育18 h后，觀察并記錄每個營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量。取相同稀釋度的3個營養(yǎng)瓊脂平板菌落平均值作為該稀釋度樣品的菌落數(shù)量。根據(jù)接種量和稀釋倍數(shù)計算每管原液中的細菌數(shù)量，并用Excel 2003處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用GraphPad Prism 5繪制細菌存活率和重組蛋白濃度關(guān)系。

細菌的存活率（%）=存活細菌數(shù)/陰性對照存活細菌數(shù)×100%。

1.2.5 不同鹽離子濃度對重組雞AvBD12蛋白抗菌活性影響

選取金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）和兔波氏桿菌（革蘭氏陰性菌）作為檢測菌，用無菌去離子水稀釋氯化鈉，使其終濃度分別為0、50、100、150 mmol·L-1。然后用上述不同NaCl濃度的緩沖液稀釋重組蛋白濃度至250 μg· mL-1，各取250 μL分別加入無菌離心管中，相應(yīng)NaCl濃度的稀釋液作為陰性對照，分別向每管加入細菌培養(yǎng)物10 μL，37℃振蕩孵育4 h。方法同試驗1.2.4

1.2.6 重組雞AvBD12蛋白對雞紅細胞的溶血活性測定

學(xué)案導(dǎo)學(xué)教學(xué)中的導(dǎo)即開導(dǎo)、啟迪之意，導(dǎo)學(xué)不是傳統(tǒng)教學(xué)意義上的輔導(dǎo)教學(xué)，這里的導(dǎo)學(xué)是以學(xué)案為依托、以素質(zhì)教育為指導(dǎo)、以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力為目的，對學(xué)生的導(dǎo)思、導(dǎo)讀、導(dǎo)練的過程。

用無菌PBS（pH 7.4）將新鮮雞血紅細胞稀釋至2%～3%，用PBS稀釋重組蛋白，使其終濃度分別為100、250、500 μg · mL-1。取20 μL蛋白分別加入無菌離心管中，同時設(shè)PBS作為陰性對照，0.2%Triton X-100作為陽性對照，分別向每管加入180 μL稀釋的紅細胞。每組設(shè)3個重復(fù)，37℃孵育1 h，1000 g·min-1離心10 min后取上清，用微量紫外分光光度計測OD560nm值。每個樣品做3個平行測定，取平均值。計算公式為：溶血指數(shù)（%）=（OD蛋白-ODPBS）/（ODTriton-ODPBS）。

1.2.7 雞AvBD12基因在組織中相對表達水平檢測

取12日齡SPF雞放血致死，無菌條件下取腺胃、氣管、腎臟、肺臟、肝臟、盲腸扁桃體、法氏囊、哈德氏腺、脾臟、直腸、小腸、盲腸、十二指腸、盲腸、胰腺組織各0.1 g，按TRIzolTM試劑盒說明方法提取總RNA。取1 μL總RNA樣品，用DEPC水按1∶10和1∶100稀釋，用微量紫外分光光度計測定其濃度。

分別以定量引物Q5/Q6、Q7/Q8為特異性引物，以雞脾臟組織為模版進行RT-PCR擴增，回收純化擴增產(chǎn)物，并與pMD18-T-Simple載體相連，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliTGⅠ感受態(tài)細胞中。篩選陽性克隆，并由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。提取陽性質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度并計算標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)，計算公式為：

標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)（copies·μL-1）=6.023×1023（copies·mol-1）×C（g·μL-1）/堿基數(shù) × 660（g·mol-1）。將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒按10倍梯度稀釋后用于構(gòu)建熒光定量檢測所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以各組織RNA為模板，重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR反應(yīng)，引物分別為Q5/Q6（AvBD12）與Q7/Q8（18S rRNA），反應(yīng)體系按 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II試劑盒說明進行操作，分別檢測AvBD12和內(nèi)參基因雞18S rRNA在各組織臟器中的相對表達量。每個樣品均做5個重復(fù)，取其平均值進行分析。

基因相對表達量=（目標(biāo)基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)）×107

1.2.8 統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用SAS 6.0軟件的ANOVA法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞AvBD12基因克隆與序列分析

采用特異性引物Q1/Q2，以雞脾臟組織RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增到約200bp的片段，結(jié)果與目的基因（198bp）大小相符（見圖1）。經(jīng)北京六合華大基因股份有限公司對質(zhì)粒PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進行核苷酸測序，得到雞AvBD12基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列。經(jīng)序列比對表明，所得到的序列與GenBank中登錄的雞AvBD12（登錄號：NM-001001607）的序列完全一致。AvBD12基因由198個堿基組成，編碼65個氨基酸殘基，分子內(nèi)含有β-防御素的特征性氨基酸基序，即由1～5、2～4、3～6 位置保守的三對二硫鍵組成，含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子。采用DNAStar軟件中Clustal V方法將雞β-防御素12氨基酸序列與其他AvBDs的序列進行比較發(fā)現(xiàn)，該基因與其他雞AvBDs氨基酸同源性較低。

圖1 雞AvBD12 RT-PCR產(chǎn)物、重組表達質(zhì)粒pProex HTa-AvBD12酶切及PCR鑒定Fig.1 Identification of RT-PCR product,the recombinant expression plasmid pProex HTa-AvBD12 digested and PCR product

2.2 雞pProex-AvBD12重組質(zhì)粒鑒定及表達和純化

將構(gòu)建的pProex-AvBD12重組表達質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xhol I雙酶切，回收目的片段。電泳結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物大小與質(zhì)粒PCR擴增得到條帶大小一致（132 bp），如圖1所示。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明將編碼雞AvBD12成熟蛋白基因正確插入原核表達載體的目的位點。將pProex-AvBD12重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于E.coliBL21（DE）plysS菌株誘導(dǎo)表達。進行Tricine-SDS-PAGE分析，并設(shè)未誘導(dǎo)的重組菌為對照，其中誘導(dǎo)后的重組菌中出現(xiàn)一條明顯的表達蛋白條帶，以分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作參照，其分子質(zhì)量約為14 ku，而對照中未出現(xiàn)，誘導(dǎo)4和5 h后表達量差異不明顯。將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲波破碎菌體后，分別取上清和沉淀Tricine-SDS-PAGE分析，可見大部分重組蛋白在沉淀中，表明重組蛋白于E.coliBL21（plysS）中以包涵體的形式存在。采用Novagen蛋白質(zhì)純化復(fù)性試劑盒對重組蛋白進行純化，獲得的重組雞AvBD12融合蛋白，運用微量紫外分光光度儀測得的濃度為1200 μg·mL-1。對純化后的蛋白進行Tricine-SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果顯示可見約14 ku大小的蛋白帶，與預(yù)期蛋白相符，如圖2所示。

圖2 重組雞AvBD12融合蛋白表達與純化Fig.2 Expression and purification of recombinant chicken AvBD12

2.3 重組雞AvBD12蛋白的抗菌活性及理化性質(zhì)測定

采用菌落計數(shù)法測定雞AvBD12重組蛋白對4種細菌的抗菌活性，如圖3所示。結(jié)果表明重組雞AvBD12融合蛋白對所測定的細菌具有顯著抑菌作用（P＜0.05）。隨著雞AvBD12重組蛋白濃度增加，細菌存活率逐漸下降，即其抗菌活性逐漸增強。其中，雞AvBD12重組蛋白對金黃色葡萄球菌和兔波氏桿菌抗菌活性較強，對豬霍亂沙門氏菌和乳酸菌的抗菌活性相對較弱，當(dāng)雞AvBD12重組蛋白濃度為50 μg·mL-1時，對兔波氏桿菌仍具有抑菌活性。

圖3 重組雞AvBD12蛋白抗菌活性Fig.3 Antimicrobial activity of recombinant chicken AvBD12 against bacterial strains

2.4 不同鹽離子濃度對重組雞AvBD12蛋白抑菌活性影響

采用菌落計數(shù)法測定重組蛋白（250 μg·mL-1）在不同鹽離子濃度下的抗菌活性。由圖4可知，隨著NaCl濃度的升高（0～150 mmol·L-1），革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（兔波氏桿菌）存活率均不斷上升，即雞AvBD12重組蛋白抗菌活性逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度為150 mmol·L-1時，重組蛋白抗兔波氏桿菌活性顯著下降（P＜0.01）。表明，高鹽離子濃度顯著降低雞AvBD12重組蛋白的抗菌活性。

圖4 不同NaCl濃度下，250 μg·mL-1的重組雞AvBD12蛋白的抗菌活性Fig.4 Effects of salinity on the antibacterial activity of recombinant AvBD12 protein with 250 μg·mL-1against bacterias

2.5 重組蛋白對雞紅細胞的溶血活性

本試驗以不同濃度的重組蛋白作為檢測對象，結(jié)果顯示重組雞AvBD12蛋白為500 μg·mL-1時，對雞血紅細胞溶血活性極低，與陰性對照差異不顯著（P＞0.05），表明重組雞AvBD12蛋白對雞血紅細胞沒有溶血的活性（見圖5）。

圖5 重組雞AvBD12蛋白的溶血活性Fig.5 Hemolysis activity of recombinant chicken AvBD12 protein

2.6 雞AvBD12基因在組織中分布

分別以雞的15個臟器組織的cDNA為模板，采用real-time PCR相對定量方法進行檢測，利用18S rRNA對雞AvBD12基因在體內(nèi)組織器官中的相對表達量進行統(tǒng)一校正，結(jié)果表明AvBD12在雞臟器組織中廣泛表達，在15個組織臟器中均有不同水平的表達。在腺胃、腎臟、十二指腸、小腸、盲腸和法氏囊的表達水平顯著高于其他組織（P＜0.05），在氣管中表達量最低（見圖6）。

圖6 AvBD12基因在雞各組織臟器中相對表達量Fig.6 Relavtive expression of AvBD12 mRNA in tissues of chicken

3 討論

本研究根據(jù)GenBank中提交的雞AvBD12的基因序列，設(shè)計特異性引物，利用RT-PCR方法從雞脾臟組織克隆得到雞AvBD12基因。測序結(jié)果表明，該基因與已發(fā)現(xiàn)的AvBDs基因一樣，含有由六個保守的半胱氨酸組成的三對二硫鍵及GXC保守結(jié)構(gòu)[6,9-10,12]，該保守氨基酸基團為β-防御素的特征性結(jié)構(gòu)。將雞AvBD12基因與其他AvBDs基因進行同源性分析比較發(fā)現(xiàn)，該基因與其他雞AvBDs氨基酸同源性較低，表明雞AvBD12基因存在較大的種屬特異性，推測造成這種現(xiàn)象的原因可能是物種進化選擇的結(jié)果。

大多數(shù)外源基因都可在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中高效表達，易于培養(yǎng)且費用低廉，為防御素生產(chǎn)自動化、產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。本試驗采用大腸桿菌BL21（DE）plysS作為表達菌株，通過融合表達方式將雞AvBD12成熟肽片段克隆到pProex HTa中，經(jīng)誘導(dǎo)實現(xiàn)雞AvBD12在大腸桿菌中高效表達。結(jié)果表明，該蛋白大部分以不溶的、無活性的包涵體形式存在。包涵體是大量表達的重組蛋白形成的致密顆粒，能保護目的蛋白不受蛋白酶降解，且不影響宿主菌生長，便于產(chǎn)物分離[19]。結(jié)果表明，純化后重組雞AvBD12融合蛋白具有廣譜抗菌活性。在500 μg·mL-1蛋白濃度條件下，對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有較強抑制作用且差異顯著；而50 μg·mL-1蛋白濃度時，對豬霍亂沙門氏菌和乳酸菌抗性較弱，本研究結(jié)果與韓宗璽等有關(guān)AvBDs的抗菌活性報道一致[12,17-18]。不同種類的防御素對細菌的抑制作用也有所不同[3-5,11]，如重組雞AvBD6和鵝AvBD3對枯草芽孢桿菌、多殺巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強抑制作用；而與鵝AvBD3相比，重組雞AvBD6對沙門氏菌、大腸桿菌的抗菌活性則較弱[12,17]。Ma等相關(guān)研究表明，已發(fā)現(xiàn)的鴨AvBDs蛋白對不同細菌的抑菌作用不同，鴨AvBD6能夠強烈地抗枯草芽孢桿菌，多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌，而對兔波士桿菌的作用一般；鴨AvBD16對奇異變形桿菌具有極強的抑制作用，對雞白痢沙門氏菌和綠膿桿菌的抗菌活性相對較弱[9]。防御素的抗菌作用可能與其（兩親性）和陽離子性分子特性有關(guān)[3-5,11]，目前，對于禽β-防御素的抗菌機制未有定論，公認(rèn)說法是防御素可以在細菌的細胞膜上形成離子通道，即防御素通過靜電作用被吸附到細菌表面，將疏水端插入細菌膜中從而改變其膜結(jié)構(gòu)，造成細菌膜穿孔進而使細菌裂解死亡[3-6]。鴨AvBD5蛋白與其他已發(fā)現(xiàn)鴨AvBDs蛋白相比，對奇異變形桿菌、大腸桿菌、兔波士桿菌、豬霍亂沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱，這可能是與鴨AvBD1（+8.89）、鴨AvBD3（+5.06）和鴨 AvBD6（+7.89）所帶的電荷相比，鴨AvBD5成熟肽段所帶正電荷數(shù)（+2.9）最少，因此削弱其抗菌活性[9]。β-防御素是禽類先天具有的免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由于其體內(nèi)缺乏過氧化氫和髓過氧化物酶而導(dǎo)致氧化機能受到影響，所以只能依賴酶、陽性蛋白和多肽等非氧化機制發(fā)揮抗菌作用[6,10,12]。

根據(jù)本試驗結(jié)果可知，在150 mmol·L-1高鹽離子濃度條件下，重組雞AvBD12蛋白抗兔波氏桿菌活性顯著下降，而對金黃色葡萄球菌仍具有很強抑制作用，但重組雞AvBD12蛋白抗兔波氏桿菌和金黃色葡萄球菌活性隨著鹽離子濃度升高而降低，表明防御素抗菌作用具有一定的鹽離子濃度依賴性。本研究抗菌試驗部分以鹽離子濃度為148 mmol·L-1的PBS作為稀釋液，其抗金黃色葡萄球菌和兔波氏桿菌活性均低于不含NaCl的處理中重組蛋白的抗菌活性，推測可能是氯離子和鈉離子對防御素抗菌活性產(chǎn)生拮抗作用，該結(jié)果與Hancock等報道結(jié)論相符[10,12]。但鹽離子濃度如何影響防御素的抗菌作用仍不明確，有待進一步研究。由試驗結(jié)果得出，重組蛋白對雞血紅細胞溶血活性極低，對細胞沒有毒性作用，這與其他AvBDs重組蛋白生物學(xué)作用的研究結(jié)果一致[12,17-18]。該現(xiàn)象可能是因為真核細胞膜上存在大量的膜蛋白、膽固醇和外層糖脂與糖蛋白組成的糖復(fù)合物糖起到物理屏障作用，阻礙防御素的疏水端插入脂質(zhì)雙分子層中，確保真核細胞膜免受損害，使細胞結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[19]。

本研究表明，AvBD12在雞的所檢測的15個組織臟器中都有廣泛表達。在腺胃、腎臟、十二指腸、小腸、大腸、盲腸、盲腸扁桃體和法氏囊的表達量較高；在肺臟、氣管、哈腺中表達量相對較低。Higg等研究表明，β-防御素基因在不同組織中表達的差異性與其相應(yīng)功能有關(guān)[7]。AvBD10在鵝和鵪鶉各組織臟器中廣泛表達，在骨髓、法氏囊、小腸、盲腸扁桃體組織中的表達量相對較高[10,20]，由此可見，防御素在腸道和免疫器官大量表達，可推測防御素作為宿主天然免疫第一道防線對抵抗病原入侵具有重要作用。此外，還可能因特定病原或外部因素誘導(dǎo)AvBDs表達，而使不同AvBDs間存在組織表達特異性[21]。Das等研究表明，精液中AvBD5、AvBD9、AvBD10和AvBD12基因的表達量因LPS刺激而顯著增加[22]。與此相似，感染腸炎沙門氏菌可誘導(dǎo)雞卵巢組織中AvBD4、5、7、11和12表達量顯著上調(diào)[23]。炎性細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）還可作為防御素（如人β-防御素2）有效的誘導(dǎo)劑和上調(diào)劑，推測防御素基因表達增強通常與病原感染引起的高度炎性反應(yīng)有關(guān)[22]。因此，防御素基因表達多態(tài)性（SNPs）可能成為相關(guān)疾病的檢測手段，可為研究宿主和病原體相互作用關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗從雞脾臟細胞中克隆到雞AvBD12基因，該基因編碼區(qū)大小為198 bp，編碼65個氨基酸。重組雞AvBD12融合蛋白分子質(zhì)量大小約為14 ku，該重組蛋白具有廣譜抗菌活性，對雞紅細胞無顯著溶血活性。高鹽濃度對重組雞AvBD12融合蛋白抗菌活性有顯著影響。AvBD12基因在雞體內(nèi)廣泛分布。

[1] Neumann G,Chen H,Gao G F,et al.H5N1 influenza viruses:outbreaks and biological properties[J].Cell Research,2010,20(1):51-61.

[2] Parsons B N,Humphrey S,Salisbury A M,et al.Invasive non-typhoidal Salmonella Typhimurium ST313 are not host-restricted and have an invasive phenotype in experimentally infected chickens[J].PLoS Negl Trop Dis,2013,7(10):e2487.

[3] Van Dijk A,Veldhuizen E J,Haagsman H P.Avian defensins[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,124(1):1-18.

[4] Sugiarto H,Yu P L.Avian antimicrobial peptides:the defense role of beta-defensins[J].Biochem Biophys Res Commol/Lun,2004,323(3):721-727.

[5] Martin E,Ganz T,Lehrer R I.Defensins and other endogenous peptide antibiotics of vertebrates[J].J Leukoc Biol,1995,58(2):128-136.

[6] 馬得瑩,韓宗璽,廖文艷.禽β-防御素的研究進展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2007,15(2):341-345.

[7] Higgs R,Lynn D J,Gaines S,et al.The synthetic form of a novel chickenβ-defensin identified in silico is predominantly active against intestinal pathogens[J].Immunogenetics,2005,57(1-2):90-98.

[8] Evans E W,Beach F G,Moore K M,et al.Antimicrobial activity of chicken and turkey heterophil peptides CHP1,CHP2,THP1,and THP3[J].Veterinary Microbiology,1995,47(3-4):295-303.

[9] Ma D,Zhang K,Zhang M,et al.Identification,expression and activity analyses of five novel duck beta-defensins[J].PLoS One,2012,7(10):e47743.

[10] Ma D,Zhou C,Zhang M,et al.Functional analysis and induction of four novel goose(Anser cygnoides)avianβ-defensins in response toSalmonella enteritidisinfection[J].Comp Immol/Lunol Microbiol Infect Dis,2012,35(2):197-207.

[11] Hancock R E,Diamond G.The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences[J].Trends in Microbiology,2000,8(9):402-410.

[12] 張名岳,周財源,韓宗璽,等.鵝β-防御素3基因的分離、鑒定及其表達產(chǎn)物的生物學(xué)特性[J].生物工程學(xué)報,2011,27(12):1711-1721.

[13] Gu Y,Dong N,Shan A,et al.Antitumor effect of the antimicrobial peptide GLI13-8 derived from domain of the avianβ-defensin-4[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2013,45(11):904-911.

[14] Yang Y,Jiang Y,Yin Q,et al.Chicken intestine defensins activated murine peripheral blood mononuclear cells through the TLR4-NF-κB pathway[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,133(1):59-65.

[15] 吳靜,史玉穎,李玉峰,等.雞β-防御素-1基因在大腸桿菌中的融合表達及其初步純化與抗菌活性測定[J].家禽科學(xué),2013,(1):7-11.

[16] Ma D Y,Liu S W,Han Z X,et al.Expression and characterization of recombinant gallinacin-9 and gallinacin-8 inEscherichia coli[J].Protein Expression and Purification,2008,58(2):284-291.

[17] 韓宗璽,廖文艷,王瑞琴,等.重組鴨β-防御素6基因的表達和生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2009(6):476-480.

[18] 廖文艷,馬得瑩,劉勝旺,等.重組雞β-防御素10蛋白的原核表達及其抗菌活性的測定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008(10):765-769.

[19] Ishitsuka Y,Pham D S,Waring A J,et al.Insertion selectivity of antimicrobial peptide protegrin-1 into lipid monolayers:effect of head group electrostatics and tail group packing[J].Biochem Biophys Acta,2006,1758(9):1450-1460.

[20] 藺利娟,王瑞琴,韓宗璽,等.鵪鶉β-防御素10基因的克隆與表達及其體內(nèi)分布的檢測[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011,33(7):552.

[21] Hellgren O,Ekblom R.Evolution of a cluster of innate immune genes(β-defensins)along the ancestral lines of chicken and zebra finch[J].Immunome Research,2010,6(1):3.

[22] Das S C,Isobe N,Yoshimura Y.Expression of Toll-like receptors and avianβ-defensins and their changes in response to bacterial components in chicken sperm[J].Poultry Science,2011,90(2):417-425.

[23] Michailidis G,Avdi M,Argiriou A.Transcriptional profiling of antimicrobial peptides avianβ-defensins in the chicken ovary during sexual maturation and in response toSalmonella enteritidisinfection[J].Research in Veterinary Science,2012,92(1):60-65.