ACOX3基因多態(tài)性對雞體脂沉積的影響

李 輝，趙士初，黃學(xué)濤，王守志

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

育種工作者對肉雞生長速度的高強(qiáng)度選擇，導(dǎo)致肉雞生長速度加快，同時(shí)產(chǎn)生體脂過度沉積、腹水綜合癥等負(fù)面效應(yīng)[1]。雞體脂主要包括腹脂、皮下脂肪和肌間脂肪。腹脂、皮下脂肪是屠宰場廢棄物主要來源，肉雞的腹脂重可達(dá)胴體重10%～15%[2]，降低經(jīng)濟(jì)效益，造成環(huán)境污染。近年來，雞體脂過度沉積問題已成為關(guān)注焦點(diǎn)。但采用傳統(tǒng)育種方法，依據(jù)個(gè)體表型值和生理生化指標(biāo)對雞脂肪性狀進(jìn)行選擇，進(jìn)展緩慢。在分子水平上研究影響體脂沉積候選基因，尋找相關(guān)分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇將是更為有效的選種方法[3-4]。

?；o酶A氧化酶3（Acyl-Coenzyme A Oxidas?es 3，ACOX3）是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化過程中的氧化酶之一，是2-甲基支鏈脂肪酸β-氧化的重要限速酶。過氧化物酶體β-氧化是植物和幾種真菌的主要脂肪酸代謝途徑[5-6]。在哺乳動物中，過氧化物酶體β-氧化與線粒體氧化體系聯(lián)合，主要分解長鏈、超長鏈和支鏈脂肪酸等[7]。此外，過氧化物酶體β-氧化體系與多不飽和脂肪酸（PUFA）合成有一定關(guān)系[8-9]。因此，可推測ACOX3基因是影響體脂沉積的重要基因之一。

雞ACOX3基因位于4號染色體，全長33090 bp，包含18個(gè)外顯子，mRNA長3013 bp。本研究以雞ACOX3基因?yàn)楹蜻x基因，選取東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇品系肉雞為試驗(yàn)材料，檢測該基因多態(tài)性，分析等位基因頻率在高、低脂系間差異，及該基因多態(tài)性對脂肪性狀影響，以期了解該基因?qū)﹄u體脂沉積影響，尋找可用于脂肪性狀分子標(biāo)記輔助選擇的遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體及基因組

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂雙向選擇品系第8世代315只公雞、9世代371只公雞、10世代610只公雞、11世代485只公雞。7周齡翅靜脈采血，血樣用4%EDTA抗凝，離心去血漿后酚仿抽提基因組，基因組DNA用TE溶解，-20℃保存。

1.2 性狀測定

7周齡屠宰，稱量活重（Body weight，BW）、腹脂重（Abdominal fat weight，AFW），計(jì)算腹脂率，用肝素-鎂簡易比濁法測定血漿極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）濃度。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank公布的雞ACOX3基因序列（NC_006091），設(shè)計(jì)ACOX3基因5'側(cè)翼區(qū)測序引物ACO5R/F（見表1），擴(kuò)增長度1411 bp。

表1 雞ACOX3基因引物Table 1 Primers of chicken ACOX3 gene

選取東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂雙向選擇品系第10世代高、低脂系各2只，白耳黃雞2只，共計(jì)6只雞的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體測序。利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對，尋找多態(tài)位點(diǎn)。

針對測序發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)以及UCSC數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu）公布的ACOX3基因多態(tài)性位點(diǎn)，利用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，見表1。

PCR反應(yīng)體系（10μL）：50ng·μL-1基因組DNA1 μL、10×PCRBuffer 1μL、10mmol·L-1dNTP0.8μL、10μmol·L-1上下游引物各0.25μL、5U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1μL、ddH2O7.1μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性7 min；34個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s、48.8～58.0℃退火30 s、72℃延伸30 s）；72℃終延伸7 min；4℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂雙向選擇品系群體的特點(diǎn)，構(gòu)建線性模型如下：

Y為性狀觀察值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，L為品系固定效應(yīng)，GE為世代固定效應(yīng)，G*L為基因型與品系的互作效應(yīng)，G*GE為基因型與世代的互作效應(yīng)，BW7作為協(xié)方差變量，e為剩余值。

家系效應(yīng)和母雞效應(yīng)對性狀無顯著影響，因此以上模型不考慮這兩個(gè)效應(yīng)。模型①②用于高、低脂雙向選擇品系不同世代混合群體，模型③④用于高、低脂雙向選擇品系單個(gè)世代。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件JMP4.0[10]，分別計(jì)算基因型與性狀的相關(guān)，估計(jì)性狀的最小二乘均值。P＜0.05表示有顯著影響，P＜0.2表示有一定影響。

基因型的顯性度計(jì)算模型如下：

d為顯性度，A為加性效應(yīng)，D為顯性效應(yīng)，AA和BB為不同等位基因的純合子的最小二乘均值，AB為雜合子的最小二乘均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型分析

2.1.1ACOX3基因c.-442A＞C位點(diǎn)的基因型分析

測序發(fā)現(xiàn)ACOX3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游442 bp處發(fā)生A＞C的突變，命名為c.-442A＞C。利用引物-442F、-442R，以肉雞高、低脂雙向選擇品系第8～11世代群體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ消化后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分型，結(jié)果顯示出3種基因型，分別命名為AA、CC、AC，見圖1。

圖1 雞ACOX3基因多態(tài)性位點(diǎn)c.-442A＞C PCR-RFLP分型膠Fig.1 PCR-RFLP pattern of the polymorphic site c.-442A＞C in chicken ACOX3 gene

2.1.2ACOX3基因c.-228C＞T位點(diǎn)的基因型分析

測序發(fā)現(xiàn)ACOX3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游228 bp處發(fā)生C＞T的突變，命名為c.-228C＞T。利用引物-228F、-228R，以肉雞高、低脂雙向選擇品系第10、11世代群體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ消化后，用14%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分型，結(jié)果顯示出3種基因型，分別命名為CC、TT、CT，見圖2。

圖2 雞ACOX3基因多態(tài)性位點(diǎn)c.-228C＞T PCR-RFLP分型膠Fig.2 PCR-RFLP pattern of the polymorphic site c.-228C＞T in chicken ACOX3 gene

2.1.3ACOX3基因c.27035A＞G位點(diǎn)的基因型分析

UCSC數(shù)據(jù)庫公布的位點(diǎn)snp.13.324.6934.S.2是位于ACOX3基因27035 bp處的A＞G突變，命名為c.27035A＞G。利用引物SNP2F、SNP2R，以肉雞高、低脂雙向選擇品系第10、11世代群體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XspⅠ消化后，用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分型，結(jié)果顯示出3種基因型，分別命名為AA、GG、AG，見圖3。

圖3 雞ACOX3基因多態(tài)性位點(diǎn)c.27035A＞G PCR-RFLP分型膠圖Fig.3 PCR-RFLP pattern of the polymorphic site c.27035A＞G in chicken ACOX3 gene

2.1.4ACOX3基因c.16802C＞T位點(diǎn)基因型分析

UCSC數(shù)據(jù)庫公布的位點(diǎn)snp.31.121.215648.S.2是位于ACOX3基因16802 bp處的C＞T突變，命名為c.16802C＞T。利用引物SNP4F、SNP4R，以肉雞高、低脂雙向選擇品系第11世代群體基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ消化后，用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分型，結(jié)果顯示出3種基因型，分別命名為TT、CC、TC，見圖4。

圖4 雞ACOX3基因多態(tài)性位點(diǎn)c.16802C＞T PCR-RFLP分型膠Fig.4 PCR-RFLP pattern of the polymorphic site c.16802C＞T in chicken ACOX3 gene

2.2 等位基因頻率分析

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂雙向選擇品系從1996年建立零世代起，根據(jù)家系及個(gè)體腹脂率和血漿VLDL濃度等指標(biāo)對體脂性狀進(jìn)行選育，到2009年已選育13個(gè)世代，兩系（低脂系、高脂系）間腹脂性狀在第4世代已顯著分離[10]。由于高脂系與低脂系的遺傳背景相同，影響雞體腹脂性狀的等位基因頻率會隨著腹脂性狀的分離而發(fā)生分離。分析等位基因頻率在兩系間的差異，將為鑒定影響雞體脂性狀的分子標(biāo)記提供依據(jù)（見表2）。

表2 ACOX3基因多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率在第8～11世代兩系間的比較Table 2 Comparisons of allele frequencies of ACOX3 gene polymorphisms in two lines of generations 8 to 11

對ACOX3基因多態(tài)位點(diǎn)在各世代中對同一世代內(nèi)不同品系間等位基因頻率進(jìn)行卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，結(jié)果表明4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)除c.27035A＞G外，c.-442A＞C、c.-228C＞T和c.16802C＞T多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率均差異極顯著（P＜0.01）（見表2，圖5）。

圖5 ACOX3基因c.-442A＞C位點(diǎn)等位基因頻率在第8～11世代低脂系變化趨勢Fig.5 Trend of allele frequencies in the lean line of generations 8 to 11

2.3 ACOX3基因多態(tài)性與雞脂肪性狀的相關(guān)分析

ACOX3基因c.-442A＞C位點(diǎn)在肉雞高、低脂雙向選擇品系第8～11世代組成的混合群體中，對脂肪性狀無顯著影響；在低脂系中，該點(diǎn)對腹脂重有顯著影響（P＜0.05），對腹脂率有一定影響（P＜0.2）；在高脂系中，該點(diǎn)對脂肪性狀無顯著影響（見表3）。各基因型最小二乘均值比較結(jié)果表明，在低脂系，AA基因型個(gè)體腹脂重和腹脂率顯著高于AC基因型個(gè)體（P＜0.05）（見表4）。

表3 ACOX3基因多態(tài)位點(diǎn)c.-442A＞C、c.-228C＞T對雞脂肪性狀的影響（P值）Table 3 Effects of ACOX3 gene c.-442A＞C,c.-228C＞T polymorphisms on chicken fat traits(P value)

表4 ACOX3基因多態(tài)位點(diǎn)對雞脂肪性狀的影響（最小二乘均值及顯性度）Table 4 Effects of ACOX3 gene polymorphisms on chicken fat traits(LSM and Degree of dominance)

ACOX3基因c.-228C＞T位點(diǎn)在肉雞高、低脂雙向選擇品系第10、11世代組成的混合群體中，對腹脂重、腹脂率及血漿VLDL濃度有顯著影響（P＜0.05）；在低脂系中，該點(diǎn)對腹脂重和腹脂率有顯著影響（P＜0.05），對血漿VLDL濃度有一定影響（P＜0.2）；在高脂系中，該點(diǎn)對血漿VLDL濃度有顯著影響（P＜0.05），對腹脂重和腹脂率有一定影響（P＜0.2）（見表3）。

各基因型最小二乘均值比較結(jié)果表明：在混合群體中，CC基因型個(gè)體腹脂重、腹脂率、血漿VLDL濃度顯著高于CT基因型個(gè)體（P＜0.05）；在低脂系，CC基因型個(gè)體腹脂重顯著高于TT基因型個(gè)體，CC基因型個(gè)體腹脂率顯著高于CT和TT基因型個(gè)體（P＜0.05）；在高脂系，CC基因型個(gè)體血漿VLDL濃度顯著高于CT基因型個(gè)體（P＜0.05）（見表4）。

ACOX3基因c.27035A＞G位點(diǎn)在肉雞高、低脂雙向選擇品系第10、11世代組成的混合群體中，對脂肪性狀沒有顯著影響；在低脂系中，該點(diǎn)對血漿VLDL濃度有顯著影響（P＜0.05），對腹脂重和腹脂率有一定影響（P＜0.2）；在高脂系中，該點(diǎn)對脂肪性狀也沒有顯著影響（見表5）。各基因型最小二乘均值比較結(jié)果表明：在低脂系，GG基因型個(gè)體腹脂重和腹脂率顯著高于AG基因型個(gè)體，GG基因型個(gè)體血漿VLDL濃度顯著高于AA和AG基因型個(gè)體（P＜0.05）（見表4）。

表5 ACOX3基因多態(tài)位點(diǎn)c.27035A＞G、c.16802C＞T對雞脂肪性狀的影響（P值）Table 5 Effects of ACOX3 gene c.27035A＞G,c.16802C＞T polymorphisms on chicken fat traits(P value)

ACOX3基因c.16802C＞T位點(diǎn)在肉雞高、低脂雙向選擇品系第11世代群體（高、低脂系混合群體）中，對脂肪性狀均無顯著影響；在低脂系中，對腹脂重和腹脂率有顯著影響（P＜0.05）；在高脂系中，對脂肪性狀均無顯著影響（見表5）。各基因型最小二乘均值比較結(jié)果表明：在低脂系，TT基因型個(gè)體腹脂重和腹脂率顯著高于TC基因型個(gè)體（P＜0.05）（見表4）。

3 討論

3.1 雞ACOX3基因多態(tài)性的群體遺傳學(xué)分析

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞腹脂雙向選擇品系由高脂系和低脂系組成，兩個(gè)品系以AA肉雞群體為共同祖先，針對腹脂和血漿VLDL濃度性狀向兩個(gè)相反的方向進(jìn)行選擇。上隨著選擇世代增加，腹脂和血漿VLDL濃度性狀分離，影響這些性狀的等位基因頻率在兩系間會逐漸分離。本研究檢測的ACOX3基因的多態(tài)位點(diǎn)c.-442A＞C、c.-228C＞T和c.16802C＞T等位基因頻率在高、低脂系間的差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）（見表2）。選擇是導(dǎo)致群體基因頻率改變的重要因素[11]，兩系間等位基因頻率的差異很有可能因體脂性狀選擇造成。推測這些位點(diǎn)可能影響體脂性狀，ACOX3基因可能與雞的體脂沉積有關(guān)。

3.2 雞ACOX3基因多態(tài)性對脂肪性狀的影響

ACOX3基因是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化過程中的重要氧化酶之一，過氧化物酶體是脂肪酸氧化的重要場所。在哺乳動物中，過氧化物酶體主要氧化分解長鏈、超長鏈和支鏈脂肪酸，過氧化物酶體的功能障礙會造成很多脂肪酸的過度沉積，引起代謝疾病[12]。組織表達(dá)規(guī)律研究表明，ACOX3在小鼠白色脂肪組織中的表達(dá)量最高[13]。本課題組研究表明，在肉雞高、低脂雙向選擇品系7周齡脂肪組織中，高脂系個(gè)體ACOX3基因的表達(dá)量是低脂系的兩倍多[14]。因此，ACOX3基因?qū)χ镜某练e有重要影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACOX3基因c.-228C＞T突變位點(diǎn)在高、低脂雙向選擇品系混合群體中，對腹脂重、腹脂率、血漿VLDL濃度有顯著影響（P＜0.05）；CC基因型個(gè)體的腹脂重、腹脂率和血漿VLDL濃度顯著高于CT基因型個(gè)體。對高、低脂系分別進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)對這些體脂性狀有不同程度影響，在低脂系中，此位點(diǎn)對腹脂重和腹脂率的影響較大，在高脂系中則對血漿VLDL濃度影響較大。在低脂系，CC基因型個(gè)體腹脂率顯著高于CT和TT基因型個(gè)體；在高脂系，CC基因型個(gè)體血漿VLDL濃度顯著高于CT基因型個(gè)體。在低脂系，顯性度分析顯示，該位點(diǎn)基因型對脂肪性狀以加性效應(yīng)為主（見表4）。基因頻率分析顯示，隨著世代選擇，C等位基因頻率在高脂系中逐漸上升，在第11世代達(dá)到0.94（見表2）。綜上可見，C等位基因可增加體脂沉積。

ACOX3基因c.-442A＞C、c.27035A＞G、c.16802C＞T突變位點(diǎn)，在高、低脂系合并分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對體脂性狀沒有影響。但對高、低脂系分別進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在低脂系中這些突變位點(diǎn)對體脂性狀有不同程度影響；在高脂系中沒有發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)對體脂性狀的影響（見表3，5）。在低脂系中，最小二乘均值比較結(jié)果表明，c.-442A＞C、c.27035A＞G、c.16802C＞T突變位點(diǎn)的雜合基因型個(gè)體腹脂重、腹脂率和血漿VLDL濃度的均值在三種基因型中最低，而且顯著低于其中一種純合子（見表4）。顯性度分析顯示，這些位點(diǎn)的基因型對脂肪性狀有超顯性效應(yīng)（見表4）。當(dāng)以腹脂重（率）和血漿VLDL濃度進(jìn)行選擇時(shí)，雜合基因型個(gè)體被選留的概率比純合基因型個(gè)體大，即為超顯性選擇。在超顯性選擇下，群體遲早將達(dá)到一種兩等位基因共存的平衡狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著世代選擇，c.-442A＞C位點(diǎn)兩等位基因在低脂系內(nèi)頻率差異有減少的趨勢（見圖4）。

研究表明，對目標(biāo)性狀的選育會導(dǎo)致品系間遺傳背景的差異[16-17]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂系雖然源自同一祖先，但是經(jīng)過數(shù)代選擇，兩系的遺傳背景已經(jīng)產(chǎn)生一定差異。本研究檢測的ACOX3基因的四個(gè)突變位點(diǎn)對低脂系脂肪性狀均有顯著影響，而對高脂系影響不顯著。由于受試驗(yàn)群體遺傳背景的影響較大，所以，本研究相關(guān)分析的結(jié)果還需在其他群體中進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究表明，ACOX3基因多態(tài)性對雞的體脂沉積有重要影響。ACOX3基因c.-228C＞T突變位點(diǎn)對雞的腹脂重、腹脂率、血漿VLDL濃度有顯著影響，可嘗試作為遺傳標(biāo)記對脂肪性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。

[1] Griffin H D.Understanding genetic variation in fatness in chickens.Annual report[M].Edinburgh,UK:Roslin institute,1996:35-38.

[2] Havenstein G B,Ferket P R,Qureshi M A.Carcass composition and yield of 1957 versus 2001 broilers when fed representative 1957 and 2001 Broiler Diets[J].Poultry Sci,2003,82(10):1509-1518.

[3] Li H,Deeb N,Lamont S J,et al.Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with the very low density apolipoprotein-II gene[J].Poultry Sci,2005,84(5):697-703.

[4] 王宇祥,李輝.生物技術(shù)在家禽育種中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(2):249-252.

[5] Hooks M A,Kellas F,Graham I A.Long-chain Acyl-coA Oxidas?es of Arabidopsis[J].The Plant Journal,1999,20(1):1-13.

[6] Kunau W H,Dommes S V,Schulz H.β-oxidation of fatty acids in mitochondria,peroxisomes,and bacteria:a century of contin?ued progress[J].Progress in lipid research,1995,34(4):267-342.

[7] Wanders R J,Peroxisomes,lipid metabolism,and peroxisomal dis?orders[J].Molecular Genetics and Metabolism,2004,83(1-2):16-27.

[8] Qiu X.Biosynthesis of docosahexaenoic acid(DHA,22:6-4,7,10,13,16,19):two distinct pathways[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,2003,68(2):181-186.

[9] Sprecher H.The roles of anabolic and catabolic reactions in the synthesis and recycling of polyunsaturated fatty acids[J].Prosta?glandins Leukot Essent Fatty Acids,2002,67(2-3):79-83.

[10] 王啟貴,史樹軍,孟和,等.肉雞血漿VLDL雙向選擇對腹脂和體重影響的研究[J].中國家禽,2002,24(2):17-18.

[11] 盛志廉,陳瑤生.數(shù)量遺傳學(xué)[M],北京:科學(xué)出版社,1999:34-56.

[12] Ronald J A,Wanders.Metabolic and molecular basis of peroxi?somal disorders[J].American Journal of Medical Genetics,2004,126A:355-375.

[13] Maria A K Westin,Mary Chunt,Stefan E H.Alexson.Peroxi?somes contain a specific Phytanoyl-CoA/Pristanoyl-CoA thioes?terase acting as a novel auxiliary enzyme in α-andβ-Oxidation of Methyl-branched tatty acids in mouse[J].J Biol Chem,2007,282(37):26707-26716.

[14] 王洪寶,王啟貴,李輝.利用基因芯片技術(shù)研究兩品種雞脂肪組織差異表達(dá)基因[J].生物工程學(xué)報(bào),2005,21(6):979-982.

[15] Wen-Hsiung Li,Dan Graur.Fundamentals of molecular evolution[M].Massachusetts USA:Sinauer Associates,Inc.1991:336-365.

[16] Koenen M,Boonstra-Blom A G,Jeurissen S H.Immunological differences between layer-and broiler-type chickens[J].Vet Im?munol Immunopathol,2002,89(122):47-56.

[17] 吳憲文,金鵬程,王守志,等.KDR等6個(gè)基因多態(tài)性與雞生長和體組成性狀的相關(guān)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(12):39-45.