羅漢松果內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

楊春貴，李 琳，魏佩瑤，羅都強(qiáng)

(河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

目前，相關(guān)研究人員已經(jīng)從羅漢松屬植物體內(nèi)分離出大量?jī)?nèi)生真菌，某些成分還具有抑癌活性、抗菌活性等[1]。羅漢松果內(nèi)生真菌Pestalotiopsis zoneata為擬盤多毛孢屬真菌，關(guān)于其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究還比較少，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)羅漢松果內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)成分研究，為其進(jìn)一步研究提供科研依據(jù)。

1 儀器與材料

BUCHI R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Bruker AVANCE III-600核磁共振譜儀，Waters高效液相色譜儀，ZF7三用紫外分析儀，Apex-Ultra7.0T高分辨傅里葉變換離子回旋質(zhì)譜儀，吹風(fēng)機(jī)，制備薄層色譜硅膠GF254，DL-1電烤爐，電子天平，柱層析色譜硅膠，Sephadex LH-20凝膠等。菌株:羅漢松果內(nèi)生真菌Pestalotiopsis zoneata，由河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

2 發(fā)酵與提取分離

2.1 種子液制備及擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵

將羅漢松果內(nèi)生真菌P.zoneata菌種接種于cPDA種子培養(yǎng)基(6L)中，搖床150r/min，26℃下培養(yǎng)8天;制作大米培養(yǎng)基20L(500mL三角瓶)高溫高壓滅菌后，將10%種子液轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基內(nèi)，26℃下持續(xù)發(fā)酵35天。

2.2 提取及分離純化

丙酮萃取菌體得浸膏33g，拌硅膠上柱子，將石油醚/乙酸乙酯按比例梯度:100/0，95/5，90/10，80/20，50/50 洗脫得到Y(jié)1-Y5五個(gè)餾分。Y2經(jīng)硅膠柱兩次層析，再經(jīng)Sephadex LH-20(CH3OH)凝膠分離得化合物3(15mg)和化合物5(17mg);Y4經(jīng)硅膠柱層析，再重結(jié)晶得化合物4(20mg);Y5經(jīng)硅膠柱層析，再上凝膠(CH3OH)分離及制備薄層(Pre-TLC)，得到化合物1(8mg)和化合物2(17mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:4-羥基-4-甲基四氫-2H-吡喃-2-酮，分子式為C6H10O3，M=130，無(wú)色晶體。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δH:1.38(3H，s)，2.65(1H，d)，2.67(1H，d)，4.34(1H，m)，4.59(1H，m).13C-NMR(150MHz，CDCl3)δC:171.17(s，C-1)，44.60(t，C-2)，67.97(s，C-3)，35.74(t，C-4)，66.23 C-5)，29.55(q，C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[2]一致。

化合物2:7-羥基-5-甲氧基-4，6-二甲基-7-O-a-L-鼠李糖苯酞，分子式為 C17H22O8，M=354，無(wú)色油狀。1H-NMR(600MHz，CD3OD):δH，1.24(3H，d)，2.21(3H，s)，2.28(3H，s)，3.52(1H，t)，3.80(3H，s)，3.91(1H，dd)，4.02(1H，m)，4.50(1H，m)，5.24(2H，d)，5.53(1H，d)。13CNMR(150MHz，CD3OD)δC:169.9(s，C-1)，68.4(t，C-2)，147.1(s，C-3)，120.8(s，C-4)，153.5(s，C-5)，125.2(s，C-6)，163.0(s，C-7)，111.7(s，C-8)，105.0(d，C-9)，70.8(d，C-10)，70.6(d，C-11)，70.9(d，C-12)，72.0(d，C-13)，10.0(q，C-14)，59.5(q，C-15)，9.2(q，C-16)，16.6(q，C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]一致。

化合物3:4-羥基苯甲酸，分子式為C7H6O3，M=138，無(wú)色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.89(2H，d)，6.83(2H， d).13C-NMR(150MHz， CD3OD) δC:121.4(s，C-1)，131.6(d，C-2)，114，6(d，C-3)，161.9(s，C-4)，114.6(d，C-5)，131.6(d，C-6)，168.7(s，C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]一致。

化合物4:4-羥基苯乙酸，分子式為C8H8O3，M=152，無(wú)色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.10(2H，d)，6.74(2H，d)，3.50(2H，s)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:125.4(s，C-1)，129.9(d，C-2)，114.8(d，C-3)，155.9(s，C-4)，114.8(d，C-5)，129.9(d，C-6)，39.7(t，C-7)，174.9(s，C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]一致。

化合物5:4-羥基苯乙醇，分子式為C8H10O2，M=138，無(wú)色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.05(2H，d)，6.72(2H，d)，3.74(2H，t)，2.73(2H，t)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:129.5(s，C-1)，129.5(d，C-2)，114.7(d，C-3)，155.3(s，C-4)，114.7(d，C-5)，129.5(d，C-6)，63.1(t，C-7)，38.0(t，C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致。

4 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)高效液相色譜制備法、凝膠色譜分離法、正反向硅膠柱色譜分離法以及制備薄層層析色譜分離法對(duì)羅漢松果內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，并采用NMR和MS等現(xiàn)代波譜分析法對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，從中首次分離鑒定出了5個(gè)化合物。該方法準(zhǔn)確可靠，為羅漢果次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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