自身免疫性肝炎與慢性乙型肝炎患者肝組織MUM-1表達(dá)的差異

蔣麗琳，陸忠華，顧娟，馮云霞，陳宏，馮一中

·短篇論著·

自身免疫性肝炎與慢性乙型肝炎患者肝組織MUM-1表達(dá)的差異

蔣麗琳，陸忠華，顧娟，馮云霞，陳宏，馮一中

目的探討自身免疫性肝炎（AIH）和慢性乙型肝炎患者肝組織多發(fā)性骨髓瘤癌基因-1（MUM-1）在漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。方法對(duì)18例AIH和20例慢性乙型肝炎患者行肝穿刺，取肝組織行免疫組化染色，應(yīng)用半定量法評(píng)估MUM-1表達(dá)的差異。結(jié)果MUM-1陽(yáng)性顆粒主要分布在界面型肝炎區(qū)的漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞核中，20例AIH患者肝組織MUM-1均陽(yáng)性，而在慢性乙型肝炎患者肝組織僅1例（5%）陽(yáng)性；AIH患者肝組織漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞MUM-1表達(dá)強(qiáng)度為（1.94±1.056）。結(jié)論MUM-1在自身免疫性肝炎患者肝內(nèi)漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞表達(dá)的意義還有待于進(jìn)一步研究。

自身免疫性肝炎；慢性乙型肝炎；多發(fā)性骨髓瘤癌基因-1；免疫組織化學(xué)

自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis，AIH）是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的一種病因不明的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，其臨床表現(xiàn)為不同程度的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、高γ-球蛋白血癥、抗自身抗體陽(yáng)性。該病在歐美國(guó)家發(fā)病率較高，在我國(guó)其確切發(fā)病率和患病率尚不清楚。迄今為止，AIH的病因和發(fā)病機(jī)制尚未得到完全闡明，遺傳易感、病毒感染、自身免疫功能異常等多種因素均可能參與其發(fā)病[1]，最終可導(dǎo)致免疫耐受失衡，引起肝內(nèi)進(jìn)行性的炎癥、壞死及纖維化。盡管該病在臨床表現(xiàn)、血液生化、自身抗體和組織病理等方面與其他慢性肝炎有不同的特點(diǎn)，然而它們有時(shí)表現(xiàn)不典型，給診斷帶來(lái)了一定的困難。新近國(guó)外的一些學(xué)者采用免疫組織化學(xué)法對(duì)不同病變肝組織漿細(xì)胞及漿母細(xì)胞進(jìn)行了比較和分析，發(fā)現(xiàn)有助于對(duì)AIH的鑒別診斷。多發(fā)性骨髓瘤癌基因（multiple myeloma oncogene 1，MUM-1）是干擾素調(diào)控因子家族成員之一，在促進(jìn)生發(fā)中心后B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在活化的生發(fā)中心后B細(xì)胞、免疫母細(xì)胞、漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞中高表達(dá)[2]。鑒于國(guó)內(nèi)尚無(wú)該方面的文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)同樣采用免疫組化方法，針對(duì)MUM-1在AIH患者和慢性乙型肝炎患者肝穿組織中漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞的表達(dá)情況，進(jìn)行了比較分析，初步探討了MUM-1檢測(cè)在AIH與其他慢性肝炎鑒別診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源收集2012年1月～2014年5月我院收治的AIH患者18例[女性17例，男性1例；年齡26～70歲，平均年齡（48.7±13.0）歲]；慢性乙型肝炎患者20例[男14例，女6例；年齡24～61歲，平均年齡（40.5±9.6）歲]。病例診斷參考2008年國(guó)際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）提出的AIH簡(jiǎn)化診斷積分系統(tǒng)及2010年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)（AASLD）更新的有關(guān)AIH的診斷和治療指南[3、4]，在AIH患者，排除肝炎病毒感染及藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病。

1.2 血液生化和抗自身抗體檢測(cè)使用AU5400型（日本奧林巴斯）全自動(dòng)生化分析儀和日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社試劑檢測(cè)血生化；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)抗核抗體（ANA，德國(guó)歐蒙公司試劑）；采用免疫印跡法檢測(cè)抗線粒體（AMA）-M2亞型抗體、抗肝腎微粒體-1（LKM-1）抗體、抗肝特異性胞質(zhì)1型（LC-1）抗體、抗可溶性肝抗原／肝胰抗原（SLA／LP）抗體（德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司）。

1.3 肝活檢組織學(xué)檢查使用BARD 14G一次性活檢針經(jīng)皮穿刺，肝組織經(jīng)石蠟包埋后連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。

1.4 肝組織MUM-1檢測(cè)采用免疫組化法，兔抗人MUM-1單克隆抗體和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。取石蠟包埋肝組織，4 μm薄切片，脫蠟至水，加檸檬酸緩沖液，微波中高火修復(fù)5 min。自然冷卻后水洗，PBS沖洗3 min×3次，滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗后再PBS洗3 min×3次，滴加二抗，室溫下40 min，PBS沖洗后再PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木精襯染，封片。為減少讀片者主觀影響，采用盲法，按Daniels et al[5]半定量評(píng)分法，在高倍物鏡（400×）下對(duì)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞MUM-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分級(jí)，分為偶見(jiàn)（1分）、少見(jiàn)（2分）、中等（3分）和顯著（4分）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

在20例慢性乙型肝炎患者中，肝組織MUM-1弱陽(yáng)性表達(dá)1例（5%），幾乎未見(jiàn)MUM-1陽(yáng)性顆粒表達(dá)(圖1）；在18例AIH患者，肝組織MUM-1均陽(yáng)性表達(dá)(100%，圖2），表達(dá)強(qiáng)度為（1.94±1.06），明顯高于慢性乙型肝炎患者（P=0.000）。MUM-1陽(yáng)性顆粒主要分布在界面性肝炎區(qū)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞胞核中(圖3），并成簇分布（圖4），在肝小葉內(nèi)亦可見(jiàn)漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞有MUM-1陽(yáng)性顆粒表達(dá)（圖5）。

圖1 慢性乙型肝炎患者肝組織MUM-1表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果為陰性（SP，200×）

圖2 AIH患者肝組織MUM-1表達(dá)情況在界面性肝炎區(qū)，有MUM-1陽(yáng)性表達(dá)的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞明顯增多（SP，200×）

圖3 AIH患者肝組織MUM-1表達(dá)情況界面性肝炎區(qū)MUM-1陽(yáng)性顆粒主要分布在漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞核中（SP，400×）

圖4 AIH患者肝組織MUM-1表達(dá)情況在界面性肝炎區(qū)，MUM-1陽(yáng)性標(biāo)記的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞成簇分布（SP，200×）

圖5 AIH患者肝組織MUM-1表達(dá)情況肝小葉內(nèi)少量MUM-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞（SP，200×）

3 討論

自身免疫性肝炎是針對(duì)肝抗原的異常免疫攻擊所造成的肝損傷。雖然ANA，抗平滑肌抗體（SMA）、抗LKM-1陽(yáng)性是典型的AIH患者的血清學(xué)標(biāo)志，但是這些抗體也能在其它疾病中檢出，無(wú)疾病特異性，不能作為AIH診斷或預(yù)測(cè)療效的決定性指標(biāo)。

AIH患者肝組織以小葉內(nèi)炎癥、變性、壞死為主，與慢性乙型肝炎病理學(xué)改變相似，表現(xiàn)為匯管區(qū)炎癥，其中可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，界面性炎癥，小葉內(nèi)肝細(xì)胞水樣變性及氣球樣變性，可見(jiàn)凋亡小體，點(diǎn)狀、灶狀或小片狀壞死，部分病例可見(jiàn)肝細(xì)胞呈玫瑰花結(jié)樣排列。界面性炎癥是AIH最具特征性的病理學(xué)改變，在界面炎區(qū)域?？梢?jiàn)到醒目、成簇排列的漿細(xì)胞浸潤(rùn)，病情繼續(xù)發(fā)展可出現(xiàn)橋樣壞死及融合性壞死和花結(jié)細(xì)胞，幾乎所有病例均存在不同程度的纖維組織增生，重癥患者可見(jiàn)纖維間隔及假小葉形成，最終病情可進(jìn)展至肝硬化[6]。在匯管區(qū)及界面性肝炎區(qū)漿細(xì)胞較多，并常聚集成簇，作為AIH的特點(diǎn)，可與其他慢性肝炎的界面性肝炎相區(qū)別[7]。

早在1999年，國(guó)際AIH小組就指出自身免疫性肝炎診斷積分標(biāo)準(zhǔn)的病理改變有3項(xiàng)，具有全部3項(xiàng)改變者加5分，即界面性肝炎3分，漿細(xì)胞浸潤(rùn)1分，肝細(xì)胞花結(jié)形成1分；而不具備者減5分?？梢?jiàn)，肝組織學(xué)是診斷AIH的關(guān)鍵參數(shù)。然而，有時(shí)匯管區(qū)界面性肝炎的炎癥細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，在HE染色中很難區(qū)分。因此，我們需要找到一種特定的方法，能夠清楚地將界面性炎癥中的漿細(xì)胞標(biāo)記出來(lái)，以便于我們對(duì)AIH診斷積分標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確判定，為臨床診斷AIH提供可靠證據(jù)。

MUM-1是一種特殊的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子[8]。有研究發(fā)現(xiàn)MUM-1缺陷小鼠會(huì)發(fā)生進(jìn)行性淋巴結(jié)病，并伴有嚴(yán)重低免疫球蛋白血癥，活化的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量明顯減少，抗體反應(yīng)低下，T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒作用或抗腫瘤反應(yīng)能力下降，說(shuō)明MUM-1對(duì)T、B細(xì)胞成熟和自穩(wěn)是必需的。在B細(xì)胞中，漿細(xì)胞、一小部分生發(fā)中心B細(xì)胞（Germinal center B cells，GCB）及生發(fā)中心后B細(xì)胞，即GCB向漿細(xì)胞成熟分化的終末階段細(xì)胞均有MUM-1表達(dá)。在T細(xì)胞中，無(wú)論是正常T細(xì)胞，還是異常活化的T細(xì)胞均有MUM-1表達(dá)[9]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一群專(zhuān)職的主動(dòng)抑制針對(duì)自身抗原或外來(lái)抗原免疫反應(yīng)的細(xì)胞，在維持免疫平衡中發(fā)揮重要作用[10]。Maria et al[11]證實(shí)AIH患者Treg細(xì)胞數(shù)量及功能均有缺陷。雖然Treg細(xì)胞不直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但AIH患者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞的自發(fā)凋亡功能存在缺陷。另有研究表明Treg細(xì)胞特異性表達(dá)Foxp3，后者對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能具有至關(guān)重要的作用[12]。Wahl et al[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3基因缺陷小鼠會(huì)引起炎癥性及自身免疫性疾病。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)AIH患者肝組織Foxp3表達(dá)顯著低于慢性乙型肝炎患者[14]。Lafdil et al認(rèn)為，IL-17受體幾乎表達(dá)于所有類(lèi)型肝臟細(xì)胞上，它主要通過(guò)刺激多種類(lèi)型的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥介質(zhì)及趨化因子，從而對(duì)肝臟造成損傷[15]。因此，我們認(rèn)為T(mén)h17細(xì)胞及其分泌的炎癥介質(zhì)可能參與了AIH的發(fā)病過(guò)程。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)方面作用相反，因此有人提出Treg／Th17細(xì)胞平衡失調(diào)可能在AIH的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用[16]。普遍認(rèn)為，AIH患者肝組織自身抗原被專(zhuān)職抗原提逞細(xì)胞（APC）以HLA-II類(lèi)分子限制形式提逞給未分化Th細(xì)胞，激活的Th細(xì)胞在IL-12或IL-4的誘導(dǎo)下分化為T(mén)h1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，并通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫及體液免疫的發(fā)生，從而引起肝細(xì)胞損傷[17]。Treg細(xì)胞的活化是抗原特異性的，活化后分泌大量的細(xì)胞因子，有針對(duì)性地抑制Th0細(xì)胞的激活，從而抑制Th1介導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)及Th2介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性[18]。MUM-1同時(shí)又是干擾素調(diào)節(jié)因子家族成員[8，19，20]。

本實(shí)驗(yàn)僅僅觀察了MUM-1在AIH患者和慢性乙型肝炎患者肝臟中漿細(xì)胞及漿母細(xì)胞的表達(dá)，而MUM-1在其它慢性肝炎患者肝內(nèi)如何表達(dá)及MUM-1在AIH發(fā)病的自身免疫調(diào)節(jié)上究竟發(fā)揮著怎樣的作用仍需要進(jìn)一步研究。

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（收稿：2014-07-21）

（校對(duì)：陳宗炳）

Expression of multiple myeloma oncogene 1 inplasma cells and plasma cell precursors in patients with autoimmunehepatitis

Jiang Lilin，Lu Zhonghua，Gu Juan，et al.Department of Pathology，F(xiàn)ifthPeople's Hospital，Wuxi 214005，Jiangsu Province，China

Feng Yizhong，E-mail:yizhongvon@163.com

Autoimmune hepatitis；Hepatitis B；Multiple myeloma oncogene 1；Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.019

214005江蘇省無(wú)錫市第五人民醫(yī)院病理科（蔣麗琳，陸忠華，顧娟，馮云霞，陳宏）；蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科（馮一中）

蔣麗琳，女，病理科醫(yī)師。主要從事肝臟病理學(xué)診斷研究。E-mail:shiqiloujj@163.com

馮一中，E-mail:yizhongvon@163.com