藥物性肝損傷發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展*

明雅南綜述，劉曉琳茅益民審校

·綜述·

藥物性肝損傷發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展*

明雅南綜述，劉曉琳茅益民審校

藥物的肝臟毒性是歐美國(guó)家導(dǎo)致急性肝衰竭的重要原因。Kaplowitz提出的以特異性“上游”事件和非特異性“下游”事件為基礎(chǔ)的DILI（Drug induced liver injury，DILI）發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展DILI機(jī)制的研究提供了明確的方向。目前已知，DILI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及藥物代謝、線粒體功能損傷、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳和環(huán)境等多個(gè)方面。DILI的發(fā)生和進(jìn)展可能是多重因素綜合作用的結(jié)果。

藥物性肝損傷；發(fā)病機(jī)制；線粒體功能損傷

藥物性肝損傷（Drug induced liver injury，DILI）不僅是導(dǎo)致西方國(guó)家急性肝衰竭和肝臟移植的最主要原因之一[1]，也是許多新藥研發(fā)失敗、上市后受到藥監(jiān)部門警示和導(dǎo)致撤市的主要原因[2]。目前已有記錄、可引起DILI的藥物種類繁多，僅美國(guó)藥物性肝損傷網(wǎng)絡(luò)（Drug induced liver injury network，DILIN）就記錄了600多種，其中中草藥和膳食補(bǔ)充劑（Herbal or supplements，HDS）以及各種用于美容塑形的藥物所占比例迅速升高，如減肥藥Oxyelite蛋白[3]。明確DILI的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防DILI的發(fā)生和明確治療靶向具有重要的意義。但目前的研究提示，DILI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及藥物代謝、線粒體功能損傷、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳和環(huán)境等多個(gè)方面。因此，DILI的發(fā)生是多重因素綜合作用的結(jié)果。

Kaplowitz[4]于2005年針對(duì)DILI的發(fā)病機(jī)制提出了特異性“上游”事件和非特異性“下游”事件的假說(shuō)，為DILI發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了明確的框架和方向?！吧嫌巍笔录侵概c特異性藥物相關(guān)的肝臟最初受到的打擊；“下游”事件是指肝細(xì)胞內(nèi)不同損傷與保護(hù)途徑之間的失衡。Russman et al[5]于2010年重新對(duì)Kaplowitz的假說(shuō)進(jìn)行了更詳細(xì)的闡述，并在此基礎(chǔ)上指出遺傳和環(huán)境因素的重要作用，提出DILI發(fā)病機(jī)制的三大主要步驟：一、藥物或者其代謝產(chǎn)物的作用：I直接損傷引起肝細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)（內(nèi)在途徑）；II激活免疫反應(yīng)（外在途徑）；III直接損傷線粒體功能；二、線粒體膜通透性改變（Mitochondrial permeability transition，MPT）；三、MPT最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的凋亡和壞死。本文對(duì)近年關(guān)于DILI發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 藥物在肝臟中的代謝

肝臟富含藥物Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝所需的各種酶，其中以P450酶最為重要。由于肝臟是藥物代謝的主要器官，因此易受到藥物導(dǎo)致的損傷。有研究表明，經(jīng)肝臟代謝超過(guò)50%以上的藥物比其他藥物更易引起肝臟的損傷[6]。對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）過(guò)量應(yīng)用是DILI發(fā)生最常見(jiàn)的原因之一。少量APAP進(jìn)入肝臟后，僅產(chǎn)生少量具有生物活性的N-乙酰-對(duì)-苯醌亞胺（N-acetyl-to-benzene quinone imine，NAPQI），NAPQI可過(guò)通過(guò)結(jié)合谷胱甘肽（Glutathione，GSH）而解毒。但過(guò)量服用APAP后產(chǎn)生的大量NAPQI在肝臟蓄積，過(guò)度消耗GSH[7]。多余的NAPQI還能夠與胞內(nèi)蛋白質(zhì)，尤其是線粒體蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，獲得免疫原性，激活特異性免疫反應(yīng)。此外，由于APAP可直接損傷肝細(xì)胞，損傷嚴(yán)重的肝細(xì)胞通過(guò)胞內(nèi)應(yīng)激原級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，協(xié)同促凋亡蛋白的作用進(jìn)一步導(dǎo)致MPT，而MPT是肝細(xì)胞死亡的重要環(huán)節(jié)。抗結(jié)核藥物異煙肼（Isoniazid，INH）經(jīng)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2（N-acetyl transferase 2，NAT2）代謝后產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，由于慢乙?；饔脤?dǎo)致具有毒性的中間代謝產(chǎn)物在肝內(nèi)堆積[8]，可直接損傷肝臟。迄今已發(fā)現(xiàn)眾多與DILI發(fā)生有關(guān)的代謝酶，但藥物代謝在促進(jìn)DILI的發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚需更多研究明確。

2 線粒體功能損傷

DILI在臨床上可分為肝細(xì)胞損傷型、膽汁淤積型和混合型。線粒體功能損傷是急性肝細(xì)胞損傷型DILI的主要原因，造成線粒體功能損傷的主要原因可能也來(lái)自三個(gè)方面：藥物或其代謝產(chǎn)物的直接損傷；細(xì)胞損傷后通過(guò)胞內(nèi)應(yīng)激原的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)和促凋亡蛋白共同作用；藥物-蛋白復(fù)合物形成，激活免疫反應(yīng)，死亡信號(hào)誘導(dǎo)復(fù)合體形成活化細(xì)胞死亡途徑。藥物或其代謝產(chǎn)物的直接損傷和氧化應(yīng)激是造成線粒體損傷的主要機(jī)制。

線粒體是機(jī)體進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所，在許多重要的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是氧化應(yīng)激損傷的重要靶細(xì)胞器。以APAP為例，多余的NAPQI與胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物是線粒體氧化應(yīng)激最重要的原因[9]，同時(shí)也是肝細(xì)胞死亡最重要的起始事件[10]。線粒體蛋白是NAPQI最重要的靶蛋白[11]，結(jié)合后可抑制受損線粒體的修復(fù)，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激，形成過(guò)硝酸鹽并降低胞內(nèi)ATP水平等，上述因素最終會(huì)導(dǎo)致MPT和肝細(xì)胞死亡[12，13]。有研究指出，在損傷早期，線粒體上Bax轉(zhuǎn)位導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G等膜間蛋白質(zhì)[14]釋放到胞質(zhì)中，細(xì)胞核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)核DNA斷裂。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是蛋白質(zhì)折疊和修飾的主要位點(diǎn)，持續(xù)損傷[15]會(huì)導(dǎo)致ER功能受損，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激反應(yīng)（Endoplasmic reticulum stress，ERS），CCAAT啟動(dòng)子綁定蛋白的同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）作為ER導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要組成部分，CHOP能夠促進(jìn)核移位，激活促壞死基因，同時(shí)抑制抗壞死基因的表達(dá)，介導(dǎo)肝細(xì)胞的死亡。Dotan Uzi et al通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷（Acetaminophen induced liver injury，AILI）中，CHOP表達(dá)升高，通過(guò)縮減細(xì)胞的再生周期等多種機(jī)制加重肝臟損傷，促進(jìn)了AILI的進(jìn)展。但氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡的準(zhǔn)確機(jī)制尚未明確，還需更深入的研究。

應(yīng)該指出，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷并非DILI特異性，在其它肝病中也是重要的發(fā)病機(jī)制之一，而且，氧化應(yīng)激本身也是機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng)，當(dāng)然，過(guò)度“應(yīng)激”也會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的損傷發(fā)生。因此，抑制細(xì)胞的過(guò)度氧化應(yīng)激，可能對(duì)肝病的治療具有普適性。

3 免疫反應(yīng)

3.1 固有免疫肝臟免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應(yīng)性免疫。常見(jiàn)的固有免疫細(xì)胞有巨噬細(xì)胞、多形核粒細(xì)胞和NK/NKT細(xì)胞。DILI患者的血液和壞死的肝細(xì)胞周圍可見(jiàn)大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)骨髓中前體巨噬細(xì)胞增殖[16]。巨噬細(xì)胞在DILI發(fā)病機(jī)制中的確切作用尚未明確，可能是由于受損的肝細(xì)胞，通過(guò)各種粘附因子和蛋白的作用，募集到受損的肝細(xì)胞周圍，吞噬已受損的肝細(xì)胞和釋放多種細(xì)胞因子?？傮w而言，活化巨噬細(xì)胞對(duì)受損肝細(xì)胞而言具有一定保護(hù)作用。

巨噬細(xì)胞中HMGB-1-TLR4-IL23-IL17A軸[17]是中性粒細(xì)胞募集和肝損傷的關(guān)鍵路線。高遷移率族蛋白（HMGB-1）是一種損傷相關(guān)蛋白（DAMPs），DAMPs可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。阻斷HMGB-1后可緩解中性粒細(xì)胞的聚集，以此判斷HMGB-1在AILI的進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。通常認(rèn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)往往會(huì)介導(dǎo)嚴(yán)重肝損傷，但Lawson J A et al[18]和Cover C[19]經(jīng)過(guò)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并非是嚴(yán)重DILI發(fā)生的關(guān)鍵因素。

NK和NKT細(xì)胞在DILI中的作用也是備受爭(zhēng)議，有研究者認(rèn)為NK/NKT細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子：IFN-γ，IL-4 et al[20]減輕毒性藥物對(duì)肝臟的損傷。也有研究者認(rèn)為這些細(xì)胞因子具有雙重作用，還有研究發(fā)現(xiàn)NK/NKT細(xì)胞的作用與藥物溶劑二甲亞砜（DMSO）密切相關(guān)。但Brittany V.Martin-Murphy et al[21]發(fā)現(xiàn)NK/NKT細(xì)胞移除的小鼠模型肝臟中保護(hù)性細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但小鼠模型的藥物敏感性卻明顯上升，可能是空腹小鼠肝臟產(chǎn)生大量酮體引發(fā)線粒體應(yīng)激所致。NK/NKT細(xì)胞可因?yàn)椴煌拇碳ざせ?，如：?xì)菌、病毒等。

近年越來(lái)越多的研究表明固有免疫在DILI中發(fā)揮了重要的作用，但對(duì)于免疫細(xì)胞是如何活化以及如何在肝內(nèi)聚集，現(xiàn)在還不清楚?？赡芘c產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物有關(guān)，也有可能與受損肝細(xì)胞釋放的DAMPs有關(guān)，目前關(guān)于這方面的研究已經(jīng)成為DILI發(fā)生機(jī)制研究的熱點(diǎn)。

3.2 適應(yīng)性免疫適應(yīng)性免疫可能是DILI的最終共同事件。大部分的固有免疫細(xì)胞具有抗原呈遞的功能，通過(guò)依賴MHCⅠ類和MHCⅡ類途徑將外源性的復(fù)合物呈遞給T和B細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。DILI適應(yīng)性免疫激活的機(jī)制目前存在兩種學(xué)說(shuō)：半抗原理論和P-i理論。

半抗原理論：現(xiàn)逐漸進(jìn)展為“危險(xiǎn)假說(shuō)”，肝細(xì)胞內(nèi)的藥物代謝產(chǎn)物通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成藥物-肽復(fù)合物，經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞（APCs）呈遞給HLA II分子，然后與CD4細(xì)胞上的T細(xì)胞受體相互作用，激活下游的細(xì)胞毒性CD8細(xì)胞（識(shí)別肝細(xì)胞上的HLAI分子呈遞的半抗原-肽復(fù)合物物）和B細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生大量針對(duì)抗原的特異性抗體和自身抗體。非甾體抗炎藥雙氯芬酸、麻醉吸入劑氟烷即可能通過(guò)這類機(jī)制激活免疫反應(yīng)。此外，肝細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和共刺激作用也受到關(guān)注，有研究提示共刺激因素可被APCs識(shí)別為危險(xiǎn)信號(hào)，通過(guò)CD4+T細(xì)胞的輔助作用，針對(duì)新抗原產(chǎn)生共刺激因子。有些藥物本身無(wú)抗原性，但是能夠通過(guò)結(jié)合HLA分子蛋白改變其肽表達(dá)，從而打破患者的免疫平衡。有時(shí)，藥物的應(yīng)用可導(dǎo)致體內(nèi)潛伏的病毒活化，免疫系統(tǒng)因?yàn)椴《镜幕罨患せ睢?/p>

p-i（pharmacological interaction）抗原學(xué)說(shuō)：即藥物相互作用假說(shuō)，部分藥物可以充當(dāng)配體作用，直接或間接結(jié)合到HLA或T淋巴細(xì)胞受體結(jié)合，通過(guò)依賴MHC型經(jīng)典模式活化T淋巴細(xì)胞，如磺胺甲基異惡唑無(wú)需生成代謝產(chǎn)物就能刺激并致敏T淋巴細(xì)胞。在希美加曲藥物毒性的研究中也得到了證實(shí)。

部分特異質(zhì)型DILI（idiosyncratic drug induced liver injury，IDILI）患者會(huì)出現(xiàn)皮疹、發(fā)熱等系統(tǒng)性過(guò)敏反應(yīng)，且IDILI與HLA之間的高度相關(guān)性也支持這一假設(shè)。氟氯西林是一類β-內(nèi)酰胺類抗生素，是導(dǎo)致膽汁淤積型DILI發(fā)生最常見(jiàn)的藥物之一。Ann K Daly et al[22]利用全基因關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）的技術(shù)比較51例氟氯西林DILI患者與年齡、種族匹配的282名對(duì)照組患者之間基因表達(dá)差異，GWAS結(jié)果顯示氟氯西林的DILI患者在主要組織相容性復(fù)合物（the major histocompatibility complex，MHC）區(qū)域HLA B*5701的完全連鎖不平衡與DILI的發(fā)生存在明顯的關(guān)聯(lián)峰值，因此研究認(rèn)為HLA B*5701等位基因可能決定了氟氯西林肝毒性的敏感性。Manal M.Monshi et al[23]對(duì)適應(yīng)性免疫激活的氟氯西林性DILI患者體內(nèi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HLA B*5701的內(nèi)源性CD45RA+CD8+T被活化，表達(dá)CCR4和CCR9的克隆T細(xì)胞向CCL17和CCL25遷移?？寺細(xì)胞在藥物的作用下分泌IFN-γ、Th2細(xì)胞因子、穿孔素、顆粒素B和FasL等細(xì)胞因子介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，而且CD8+T細(xì)胞的活化受到HLA B*5701的限制。除阿巴卡韋外，其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物也發(fā)現(xiàn)了類似的反應(yīng)。Manal M.Monshi et al[23]的研究首次闡述了適應(yīng)性免疫在氟氯西林性肝損傷中的作用，并為建立基因差異與疾病之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

4 環(huán)境因素和遺傳因素

DILI的影響因素眾多，種族[24～26]、年齡、性別、藥物種類、劑量、給藥途徑、聯(lián)合用藥、遺傳因素、飲食習(xí)慣[27]、營(yíng)養(yǎng)不良，肝臟基礎(chǔ)病變[28]等都可能影響患者對(duì)DILI的易感性。有研究發(fā)現(xiàn)年齡和性別與DILI發(fā)生并無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)[29]，而不同年齡段機(jī)體狀況和所用藥物差別可能是導(dǎo)致DILI類型差別的原因所在。

DILI存在個(gè)體差異性，對(duì)藥物毒性的敏感性存在差異，因此基因差異是決定特異性DILI發(fā)生的重要因素。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）研究顯示，氟氯西林肝毒性的高敏感性與HLA存在明顯的關(guān)聯(lián)，所以HLA基因多態(tài)性成為當(dāng)前DILI研究的熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究證明HLA基因變異是DILI發(fā)生的一個(gè)最重要的危險(xiǎn)因素[30]：HLA-B*5701[31]與氟氯西林的肝毒性敏感性增高有關(guān)，HLA-DRB1*0701[32]與希美加曲有關(guān)。其他與DILI有關(guān)的易感基因還有HLA-DRB1*15（阿莫西林-克拉維酸）、HLA-DQA1*0102（羅來(lái)昔布）、HLA A*3303（噻氯吡啶）、HLA-DQA1*201（拉帕替尼）、CYP2E1野生型（異煙肼）、GSTM1基因缺失（抗結(jié)核藥物）、GSTM1-GSTT1[33]雙重缺失（阿莫西林-克拉胃酸）、MTHFR C677T[34]（低劑量甲氨蝶呤）等。

GWAS主要是用于篩選與疾病發(fā)生相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。INH是最常用的抗結(jié)核藥物，如前所述，其毒性與N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2（NAT2）的慢乙?；嘘P(guān)[35]。Garcia-Closas M et al[36]首先在歐洲人NAT2基因上發(fā)現(xiàn)一種與NAT2的催化活性有關(guān)的新型單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs1495741。隨后Hsin-Tien Ho et al[37]在臺(tái)灣人中再次證實(shí)了該SNPs對(duì)INH血藥濃度的時(shí)間變化、清除率、代謝率以及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都存在明顯影響。近來(lái)研究表明GWAS能夠有效的識(shí)別與DILI有關(guān)的基因變異因素，如能用于臨床，就能夠鑒別關(guān)于某種藥物的敏感群體。

5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與肝細(xì)胞死亡機(jī)制

肝細(xì)胞死亡是不同藥物引起DILI的共同“終點(diǎn)”事件。因此研究肝細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路并尋求阻斷該通路的方法理所當(dāng)然成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。肝細(xì)胞主要死亡方式有三種：凋亡、壞死和自噬。細(xì)胞自噬是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，可通過(guò)巨吞噬的方式清除受損的線粒體和細(xì)胞，防止損傷后AIF和核酸內(nèi)切酶G等釋放到細(xì)胞外，誘導(dǎo)其他肝細(xì)胞凋亡。

線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，線粒體損傷和氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，是細(xì)胞凋亡或壞死必要的中間環(huán)節(jié)，常見(jiàn)的比較明確的細(xì)胞凋亡途徑在DILI中都可見(jiàn)，如Fas-FasL途徑、Capase途徑等。Fas-FasL途徑是與免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，Capase途徑是重要的線粒體損傷細(xì)胞凋亡途徑，肝細(xì)胞中Fas-FasL途徑Caspase-8啟動(dòng)不能達(dá)到較高的水平，需要線粒體途徑放大。此外，肝細(xì)胞壞死產(chǎn)生的炎性反應(yīng)和細(xì)胞因子也能促進(jìn)Fas-FasL途徑的活化，這幾種途徑之間相互加強(qiáng)，最終形成瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞大量死亡。

Anup Ramachandran et al[38]發(fā)現(xiàn)AILI早期存在一種介導(dǎo)肝細(xì)胞由凋亡向壞死轉(zhuǎn)變的大分子物質(zhì)—受體相互作用蛋白（Receptor Interacting Protein Kinase 3，RIP-3），通過(guò)活化JNK、直接損傷，導(dǎo)致線粒體裂解，釋放AIF和核酸內(nèi)切酶G，最終致細(xì)胞壞死。壞死的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間隙連接蛋白[39]將上述誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死物質(zhì)向周圍細(xì)胞傳遞，進(jìn)而引起周圍細(xì)胞壞死。阻斷壞死信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞可以減少肝細(xì)胞的死亡，是治療DILI的重要途徑。

6 小結(jié)與展望

總之，目前了解到的DILI發(fā)病機(jī)制，還只是冰山一角，DILI的發(fā)生和進(jìn)展可能是上述因素相互作用的綜合結(jié)果。因此，針對(duì)DILI機(jī)制的研究和探討是目前最具挑戰(zhàn)且亟需解決的難題之一。

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（收稿：2014-08-22）

（校對(duì)：張駿飛）

The pathogenesis of drug-induced liver injury（DILI）

Ming Yanan，Liu Xiaolin，MaoYimin.Shanghai Institute of Digestive Disease，Renji Hospital，Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine，Shanghai，China.

Drug-inducedliver injury；pathogenesis

“十二五”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09303-001，2012ZX09401004）

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市消化疾病研究所

明雅南，女，24歲，碩士研究生。主要從事藥物性肝損傷的研究。E-mail:mingynjd@163.com

茅益民，Email:maoym11968@163.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.027

DILI is the most important cause of acute liver failure in the U.S.The emerging concept of drug-specific“upstream”events that cause initial hepatocyte injury and less specific“downstream”events described by Kaplowitz，which provides clear direction for further DILI mechanism research.Currently，it's well-know that the mechanism of DILI is complex，involving drug metabolism，mitochondrial dysfunction，immune response，signal transduction，genetic and environmental et al.Progression of DILI may be the result of the combined effects of multiple factors.