聚肌胞苷酸誘導(dǎo)的早期原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠模型的建立*

郭曉霞，李良學(xué)，武玉鵬，賈麗莉，劉改萍，白崇智

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

聚肌胞苷酸誘導(dǎo)的早期原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠模型的建立*

郭曉霞，李良學(xué)，武玉鵬，賈麗莉，劉改萍，白崇智

目的探討應(yīng)用聚肌胞苷酸建立早期原發(fā)性膽汁性肝硬化動(dòng)物模型。方法30只雌性C57BL/6小鼠被隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組。模型組小鼠腹腔注射聚肌胞苷酸（5 mg.kg-1），對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水，均2次/w，于8 w、16 w和24 w分別檢測(cè)血清抗線粒體抗體M2亞型、外周血CD4+CD25+Foxp3+計(jì)數(shù)，以及肝組織CK19表達(dá)情況。結(jié)果在24 w末，模型組AMA-M2陽性率為100%（5/5），顯著高于對(duì)照組（0/5）；在8 w、16 w和24 w，模型組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（3.48±0.95）%、（3.30±1.55）%和（2.67±0.97）%，均顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組水平[（7.25±1.63）%、（6.33±1.06）%和（5.58±1.52）%，P＜0.05]；兩組肝組織CK19表達(dá)無顯著性差異；病理學(xué)檢查顯示模型組小鼠肝組織匯管區(qū)和膽管周圍炎性細(xì)胞浸潤呈進(jìn)行性加重，細(xì)小膽管增生，出現(xiàn)膽汁性碎屑樣壞死和橋接纖維化，但未出現(xiàn)肝硬化。結(jié)論聚肌胞苷酸注射可成功建立早期原發(fā)性膽汁性肝硬化動(dòng)物模型，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞可能在發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

原發(fā)性膽汁性肝硬化；聚肌胞苷酸；動(dòng)物模型；小鼠

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biIiary cirrhosis，PBC）是一種自身免疫性、慢性進(jìn)行性膽汁淤積性肝臟疾病。該病以肝臟門靜脈炎性細(xì)胞浸潤和免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的肝小葉膽管損傷為特征，常見于中年女性[1]，近年來發(fā)現(xiàn)該病也可累及年輕的育齡婦女和男性[2]。PBC的肝臟病理學(xué)改變主要以肝內(nèi)細(xì)小膽管慢性非化膿性破壞、匯管區(qū)炎癥、慢性膽汁淤積和肝纖維化為特征。其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，推測(cè)可能與自身免疫、感染和細(xì)胞病變有關(guān)[3]。為此，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[4，5]，以聚肌胞苷酸（Polyinosinic-polycytidylicacid，poly I:C）腹腔注射建立早期PBC小鼠模型，旨在為進(jìn)一步研究原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)病機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立8周齡雌性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量約（20±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，均飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為模型組（n=15）和對(duì)照組（n=15）。在標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，給予模型組Poly I:C（Sigma公司，50 mg分裝）5 mg.kg-1腹腔注射，2次/w，直至24 w；給予對(duì)照組小鼠等體積生理鹽水腹腔注射，2次/w，直至24 w。實(shí)驗(yàn)中每隔8周每組取5只小鼠處死，行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2 血清抗線粒體抗體M2亞型（AMA-M2）檢測(cè)自小鼠眼眶采血，留取血漿，采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AMA-M2（歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司）。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入AMA-M2，再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-抗原復(fù)合物，在徹底洗滌后，加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中AMA-M2呈正相關(guān)。在酶標(biāo)儀450 nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品AMA-M2水平。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查取肝臟于冰生理鹽水中清洗，在10%緩沖福爾馬林固定液中固定，石蠟包埋，切片，行HE、PASM及Massom染色，鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

1.4 肝組織細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）表達(dá)的檢測(cè)選取與常規(guī)HE切片系同一個(gè)蠟塊組織的連續(xù)切片，根據(jù)HE切片中的組織學(xué)表現(xiàn)，選定各級(jí)別病變所對(duì)應(yīng)的區(qū)域，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法檢測(cè)肝組織CK19（Santa Cruz公司）的表達(dá)情況。CK19為膽管上皮細(xì)胞的特異表達(dá)蛋白，在免疫組化染色后，棕色為CK19陽性表達(dá)，應(yīng)用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus）計(jì)算各組標(biāo)本陽性細(xì)胞數(shù)與陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度。結(jié)果判斷參照免疫組織化學(xué)染色計(jì)分（immunohistochemical scores，IHS）評(píng)判[6，7]：即，IHS=A×B。A為陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0%～1%=0，1%～10%=1，11%～50%=2，51%～80%=3，81%～100%=4； B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)：0（陰性），1（弱陽性），2（陽性），3（強(qiáng)陽性）。

1.5 外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的檢測(cè)取小鼠外周血清，將抗CD4、CD25和Foxp3組合抗體（德國Beckmann化學(xué)公司）分別加入到抗凝血100 μl中，振蕩混勻，避光放置15 min，在溶血儀裂解紅細(xì)胞后上機(jī)（美國Beckman coulter 3XL）檢測(cè)。以FITC、PE和PC5標(biāo)記的小鼠IgG作為同型對(duì)照。設(shè)門確定T淋巴細(xì)胞分布位置，計(jì)算各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清AMA-M2檢測(cè)情況在不同時(shí)間模型組和對(duì)照組動(dòng)物血清AMA-M2陽性率如表1所示，隨著造模時(shí)間的延長，模型組血清AMA-M2陽性率持續(xù)升高，第24 w所有動(dòng)物血清呈陽性，而對(duì)照組小鼠血清在各階段中均為陰性。

表1 兩組小鼠血清AMA-M2陽性率（%）比較

2.2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)照組小鼠肝臟呈粉紅色或絳紅色，表面光滑清晰。肉眼可見模型組小鼠肝臟腫大，色澤黃變；在造模8 w后，模型組小鼠肝組織匯管區(qū)擴(kuò)大，周圍纖維化，淋巴細(xì)胞浸潤（圖1A）；在第16 w，匯管區(qū)周邊出現(xiàn)細(xì)小的膽管增生及炎性細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)小膽管周圍也開始出現(xiàn)纖維化（圖1B）；至第24 w時(shí)，肝組織匯管區(qū)界板出現(xiàn)膽汁性碎屑樣壞死和橋接纖維化（圖1C）；對(duì)照組小鼠肝組織在不同階段均結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)及膽管周圍未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤（圖1D～F）。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，PASM，MASSOM，100×）

2.3 肝組織CK19表達(dá)情況在模型組肝組織中，隨著造模時(shí)間的延長，肝組織CK19表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，間質(zhì)中膽管增加，并出現(xiàn)假膽管，均呈陽性著色，見圖2（A～C）；在正常肝組織中，間質(zhì)中膽管有CK19表達(dá)，呈陽性著色，但幾乎看不到明顯增生活躍的膽管上皮細(xì)胞，見圖2（D～F），但兩組肝組織CK19免疫組化評(píng)分比較，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 兩組小鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞CK19表達(dá)IHS評(píng)分（）比較

表2 兩組小鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞CK19表達(dá)IHS評(píng)分（）比較

圖2 兩組小鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞CK19表達(dá)的變化（SP，400×）

2.4 外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化隨著造模時(shí)間的延長，模型組和對(duì)照組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例均呈下降趨勢(shì)，但模型組下降更為明顯，與對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3和圖3）。

表3 兩組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞計(jì)數(shù)（%）的變化

3 討論

Poly I:C是一種I型干擾素，在自身免疫病的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮作用[8～12]。Poly I:C可以誘導(dǎo)PBC樣動(dòng)物模型，但是其確切的作用機(jī)制尚不清楚。本研究采取PolyI:C給C57BL/6小鼠腹腔注射建立PBC模型，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著造模時(shí)間的延長，模型組小鼠血清AMA-M2陽性率呈逐漸升高趨勢(shì)，第24 w可達(dá)到100%，而對(duì)照組小鼠血清在各階段中均為陰性，提示本研究制備PBC模型成功，因而具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

圖3 兩組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞計(jì)數(shù)變化

肝組織活檢是確診PBC的重要依據(jù)，其肝組織學(xué)上可分為四期[13]：I期為門管區(qū)炎伴有膽小管肉芽腫性破壞；II期為門脈周圍炎伴膽管增生；III期可見纖維間隔和橋接壞死形成；IV期為肝硬化期。在造模過程中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肝臟組織未發(fā)生明顯的病理學(xué)改變，模型組在Poly I:C注射后匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，隨著造模時(shí)間的延長，模型組肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤呈進(jìn)行性加重，匯管區(qū)逐漸擴(kuò)大，周邊部出現(xiàn)細(xì)小膽管增生，淋巴細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)小膽管周圍也開始出現(xiàn)炎性反應(yīng)及纖維化；至第24 w時(shí)，模型組肝組織匯管區(qū)界板出現(xiàn)膽汁性碎屑樣壞死和橋接纖維化，但未出現(xiàn)肝硬化，說明模型組小鼠肝組織在向III期進(jìn)展，可能為早期PBC。

CK19是膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，在正常肝組織中,膽管上皮細(xì)胞陽性表達(dá)，而肝細(xì)胞呈陰性表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在模型動(dòng)物肝組織中，隨著造模時(shí)間的延長，肝組織間質(zhì)中膽管、假膽管及增生的膽管呈CK19陽性著色，呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，提示膽管增生活躍。但直至24 w并未發(fā)現(xiàn)膽管缺失、閉鎖等晚期PBC的病理學(xué)改變，提示該模型僅符合人類PBC早期病理學(xué)變化。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞以及NKT細(xì)胞等對(duì)肝臟淋巴細(xì)胞浸潤、膽管上皮細(xì)胞損傷以及AMA的產(chǎn)生發(fā)揮著重要的作用[15]。Th細(xì)胞在介導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生以及維系膽管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫功能方面發(fā)揮舉足輕重的作用[10]。在PBC病人的外周血和受累的膽管周圍都被證實(shí)有CD4+的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在[16]。研究表明CD4+CD25+Treg細(xì)胞的形成及活化對(duì)維持外周免疫耐受、控制過度免疫應(yīng)答及免疫相關(guān)疾病的發(fā)生至關(guān)重要[17]，可使細(xì)胞免疫應(yīng)答能力下降，從而導(dǎo)致疾病不斷進(jìn)展甚至惡化，尤其與PBC發(fā)生、發(fā)展及膽小管和肝細(xì)胞的破壞有關(guān)[16]。Foxp3+是控制Treg分化的核心轉(zhuǎn)錄因子，在CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和功能發(fā)揮方面都起到?jīng)Q定性的作用[18]。

本研究以PolyI:C腹腔注射建立小鼠PBC動(dòng)物模型，在24 w后對(duì)PBC小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+所占比例進(jìn)行流式分析。結(jié)果表明，模型組和對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+計(jì)數(shù)均呈下降趨勢(shì)，但模型組下降更為明顯，兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組小鼠細(xì)胞的變化與C57BL/6小鼠本身具有一定的自身免疫傾向有關(guān)，而Poly I:C能夠加快其自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展。本文觀察到PBC小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞所占比例呈明顯下降趨勢(shì)，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與國外對(duì)PBC患者的研究結(jié)果一致[19]。本實(shí)驗(yàn)提示CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)低下或絕對(duì)數(shù)減少可能是原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病以及病情加重的因素之一，這也為通過體外培養(yǎng)增殖調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，回輸給患者發(fā)揮免疫抑制作用，以糾正患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相對(duì)平衡[20]，提供了一定的依據(jù)。

本研究表明，應(yīng)用PolyI:C給C57BL/6小鼠腹腔注射可以成功制備早期原發(fā)性膽汁性肝硬化動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞可能在原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步研究原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)病機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]Talwalkar JA，Souto E，Jorgensen RA，et al.Natural history of pruritus in primary biliary cirrhosis.Clin Gastroenterol Hepatol，2003，1（4）:297-302.

[2]Hirschfield GM.Diagnosis of primary biliary cirrhosis.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25（6）:701-712.

[3]段維佳，賈繼東.原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷和治療.胃腸病學(xué)，2009，14（4）:209-213.

[4]馬歡，王邦茂.原發(fā)性膽汁性肝硬化動(dòng)物模型研究進(jìn)展.國際消化病雜志，2012，32（2）:93-95.

[5]Concepcion AR，Medina JF.Approaches to the pathogenesis of primary biliary cirrhosis through animal models.Clinics Res Hepatol Gastroenterol，2012，36（1）:21-28.

[6]許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國癌癥雜志，1996，6（4）:229-231.

[7]Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed inhumanpulmonary，colonic，andmammarytumors.Cancer，2000，89（12）:2637-2645.

[8]LleoA，InvernizziP，MackayIR，etal.Etiopathogenesisof primary biliary cirrhosis.World J Gastroenterol，2008，14（21）: 3328-3337.

[9]McNally RJ，James PW，Ducker S，et al.Seasonal variation in the patient diagnosis of primary biliary cirrhosis:further evidence foranenvironmentalcomponenttoetiology.Hepatology，2011，54（6）:2099-2103.

[10]Invernizzi P，Selmi C，Gershwin ME.Update on primary biliary cirrhosis.Dig Liver Dis，2010，42（6）:401-408.

[11]劉然，陸倫根.抗線粒體抗體對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷價(jià)值研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（2）:218-221.

[12]Braun D，Geraldes P，Demengeot J.Type I interferon controls the onset and severity of 232232autoimmune manifestations in lpr mice.J Autoimmun，2003，20（1）:15-25．

[13]自身免疫性肝病診斷和治療指南.中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì).中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（8）:556-558.

[14]Hsia CC，Evarts RP，Nakatsukasa H，et al.Occurrence of oval-typecellsinhepatitisBvirus-associatedhuman hepatocarcinogenesis.Hepatology，1992，16（6）:1327-1333.

[15]Kaplan MM，Gershwin ME.Primary biliary cirrhosis.N Engl J Med，2005，353（12）:1261-1273.

[16]BernuzziF，F(xiàn)enoglioD，BattagliaF，etal.Phenotypicaland functional alterations of CD8 regulatory T cells in primary biliary cirrhosis.J Autoimmun，2010，35（3）:176-180.

[17]劉娟，曹雪濤.2012年度免疫學(xué)研究重要進(jìn)展.中國免疫學(xué)雜志，2013，29（1）:3-13.

[18]Ramsdell F.Foxp3 and natural regulatory T cells:key to a cell lineage.Immunity，2003，19（2）:165-168.

[19]許茵，楊小娟，蒯守剛.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)及其臨床意義.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，18（4）:592-594.

[20]Muratori L，Longhi MS.The interplay between regulatory and effector T cells in autoimmune hepatitis:Implications for innovative treatment strategies.J Autoimmun，2013，46（17）:74-80.

（收稿：2014-06-20）

（校對(duì)：陳從新）

Establishment of a mouse model of early primary biliary cirrhosis by polyinosinic-polycytidylic acid

Guo Xiaoxia，Li Liangxue，Wu Yupeng，et al.Department of Liver Diseases，Traditional Chinese Medicine Hospital，Taiyuan 030012，Shanxi Province，China

ObjectiveTo establish an animal model of early primary biliary cirrhosis（PBC）by injection of polyinosinic-polycytidylic acid（Poly I:C）．MethodsThirty female C57BL/6 mice were randomly divided into model and control group.Mice in model group were injected with poly I:C at a dose of 5 mg.kg-1while animals in control with equal volume of saline for 24 weeks.The antimitochondrial antibody-M2（AMA-M2），CD4+CD25+Foxp3+cells were detected at 8，16 and 24 weeks.Histological changes of liver samples were evaluated with HE，PASM，and masson trichrom staining and CK19 was detected by anti-CD19 antibody staining at each stage. ResultsThe positive rate of AMA-M2 in model group at week 24 was 100%（5/5），significantly higher than in the control group（0/5）；The percentages of CD4+CD25+Foxp3+Tregs in the peripheral blood in model group at week 8，16 and 24 were（3.48±0.95）%，（3.30±1.55）%and（2.67±0.97）%，all of which significantly lower than those in the control group at each corresponding time[（7.25±1.63）%，（6.33±1.06）%and（5.58±1.52）%，P＜0.05]；The expression of CK19 in liver tissues showed no significant difference between the two groups；Liver pathology showed progressively increased infiltration of inflammatory cells around the portal area and bile duct，small bile duct proliferation，bilious fragmental necrosis and bridging fibers in model group.ConclusionsThe animal model of early PBC is successfully established by injection of Poly I:C and the CD4+CD25+Foxp3+T cells may play a critical role in the pathogenesis ofthe entity.

Primary biliary cirrhosis；Polyinosinic-polycytidylic acid；Mouse；Animal model

山西省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：201301019）

030015太原市山西省中醫(yī)院肝病科（郭曉霞）；山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室（武玉鵬，賈麗莉，白崇智）；山西省中醫(yī)院病理科（劉改萍）；山西省中醫(yī)藥研究院碩士研究生（李良學(xué)）

郭曉霞，女，38歲，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。主要從事中醫(yī)藥防治慢性肝病研究。E-mail: gxxsunny@hotmail.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.015