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      殼聚糖固定化脲酶生物傳感器選擇性測(cè)定銅離子

      2014-03-11 12:44:54曾憲冬張資平
      化學(xué)傳感器 2014年3期
      關(guān)鍵詞:脲酶抑制率殼聚糖

      曾憲冬,柳 潔,張資平,孔 舒

      (1.深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心,廣東深圳518054)

      (2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái)264005)

      0 引言

      銅離子是一種重要的環(huán)境污染物,超過(guò)一定的濃度就會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成危害。檢測(cè)環(huán)境、生物及其它實(shí)際樣品中的銅離子是非常重要的[1~3]。目前用于測(cè)定銅離子的通用方法有原子吸收光譜法(AAS)[4~6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[7]等。這些方法存在儀器昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、不易攜帶等缺點(diǎn),在連續(xù)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等方面受到很大限制。生物傳感器作為一種新的檢測(cè)手段,具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、成本低廉、能在復(fù)雜的體系中快速檢測(cè)等特點(diǎn)。由于重金屬離子對(duì)許多酶的活性具有抑制作用,因此,構(gòu)建用于檢測(cè)重金屬離子的酶抑制型生物傳感器引起了廣泛研究關(guān)注[8~10]。酶抑制型生物傳感器常用的酶包括脲酶、過(guò)氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶和乙酰膽堿脂酶等。其中脲酶由于廉價(jià)易得,故而使用最廣泛。但是酶的活性往往可以受到多種重金屬離子的抑制,因此如何改善酶抑制型生物傳感器的選擇性,實(shí)現(xiàn)特定重金屬離子的檢測(cè),成為這一研究領(lǐng)域的重要課題。

      殼聚糖(CS)是一種線性的親水性多聚糖,一般通過(guò)天然的甲殼素脫乙酰獲得。由于其具有很好的生物相容性和極好的成膜特性,廣泛用于酶生物傳感器的構(gòu)建[11~13]。同時(shí),殼聚糖對(duì)于重金屬離子具有吸附富集作用[14],用殼聚糖作為固定載體,有利于提高重金屬離子檢測(cè)的靈敏度。該研究工作利用殼聚糖將脲酶固定于pH 電極表面,構(gòu)建了用于Cu2+檢測(cè)的傳感器,通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,實(shí)現(xiàn)了Cu2+的選擇性檢測(cè)。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 儀器和試劑

      PXJ-1B型數(shù)字式離子計(jì) (江蘇電分析儀器廠),E-901型pH 平面復(fù)合電極 (上海羅素科技有限公司),X-7 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)。

      殼聚糖(脫乙酰度>75%)、洋刀豆脲酶(EC 3.5.1.5,50~100 unit/mg)購(gòu)自Sigma 公司,重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量研究院,使用時(shí),用0.05 mol/L pH6.0 的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至一定濃度作為酶抑制劑。尿素(>99.5%)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司,將其溶解于0.05 mol/L pH6.0 的PBS 中配成5 mmol/L 的溶液做為酶促反應(yīng)的底液。其余試劑均為分析純。

      1.2 生物傳感器的構(gòu)建

      殼聚糖用1%(V/V)醋酸溶解,攪拌大約4 h,使殼聚糖固體完全溶解然后過(guò)濾除去可能存在的不溶性雜質(zhì),所配殼聚糖溶液濃度為2%(W/V)。稱取適量的脲酶,加入到pH6.0 的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,配制成10%的脲酶溶液。為獲得好的響應(yīng)性能,對(duì)脲酶溶液與殼聚糖溶液的比例進(jìn)行了優(yōu)化,最優(yōu)條件為1 體積的脲酶溶液與5 體積的殼聚糖溶液進(jìn)行混合。然后用微量注射器取10 μL 混合液滴于處理好的pH 電極表面,再用一個(gè)燒杯蓋在電極上面,使溶劑緩慢揮發(fā)以得到均勻的膜層。制備好的生物傳感器在使用前,先浸泡在pH6.0 的PBS 中1 h 后用純水沖洗,以便酶修飾層溶脹和除去殘留的醋酸。

      1.3 Cu2+的檢測(cè)

      首先將制備好的生物傳感器置于尿素溶液中,測(cè)定經(jīng)過(guò)一定時(shí)間酶促反應(yīng)引起的電位變化ΔE,然后用緩沖溶液沖洗電極,使其電位回復(fù)至初始電位。將生物傳感器浸入含Cu2+的溶液一段時(shí)間,使酶的活性受到抑制,再將其置于尿素溶液中,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間酶促反應(yīng)引起的電位變化為ΔE′。通過(guò)抑制前后電位變化的差異可以計(jì)算出Cu2+對(duì)脲酶活性的抑制率,計(jì)算公式為:

      根據(jù)不同濃度Cu2+下抑制率的變化,可獲得抑制率與重金屬離子濃度間的響應(yīng)曲線。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 生物傳感器的電位響應(yīng)

      將制備好的脲酶生物傳感器置于尿素溶液中,pH 電極的電位響應(yīng)如圖1中a所示,由于固定于pH 電極表面的脲酶催化作用,尿素溶液發(fā)生水解,引起pH 電極的電位發(fā)生變化。而將脲酶生物傳感器先浸入含Cu2+的溶液一段時(shí)間后,再將其置于尿素溶液中,電位響應(yīng)如圖1中b所示,可以看到,電位變化的趨勢(shì)與a 相似,但是電位變化值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于前者,這一現(xiàn)象說(shuō)明,Cu2+能明顯抑制脲酶的活性。

      2.2 生物傳感器測(cè)定條件的優(yōu)化

      2.2.1 酶促反應(yīng)時(shí)間的選擇

      從圖1中可以看出,在開(kāi)始的5 min 里,隨著尿素的酶催化水解反應(yīng)發(fā)生,生物傳感器的電位響應(yīng)逐漸增大,5 min 后,由于水解反應(yīng)接近平衡,電位響應(yīng)也趨于穩(wěn)定,因此,酶促反應(yīng)的時(shí)間選定為5 min。

      2.2.2 抑制時(shí)間的影響

      酶與Cu2+溶液的接觸時(shí)間會(huì)影響到其對(duì)酶活性的抑制效果。不同抑制時(shí)間下,脲酶活性的抑制率如圖2所示,從圖中可以看出,在30 min 以內(nèi)隨著抑制時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率逐漸增大;30 min 后,抑制率不再發(fā)生明顯變化。這是由于在30 min 后,Cu2+與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合達(dá)到了平衡,因而其對(duì)酶活性的抑制率也不在發(fā)生變化,因此,在該試驗(yàn)中,酶抑制的時(shí)間選定為30 min。

      圖1 生物傳感器在5 mmol/L 的尿素溶液中電位響應(yīng):(a)酶未被抑制,(b)酶被0.2 μg/mL Cu2+抑制30 min 后Fig.1 The potential response curve of the biosensor in 5 mmol/L urea solution:(a)the activity of urease was not inhibited,(b)the activity of urease was inhibited by 0.2 μg/mL Cu2+for 30 min

      圖2 抑制時(shí)間對(duì)酶活性抑制率的影響Fig.2 Dependence of inhibition rate(I)on inhibition time

      2.2.3 生物傳感器選擇性的改善

      除了Cu2+以外,其他重金屬離子,尤其是Hg2+與Ag+,對(duì)于脲酶的活性也具有很強(qiáng)的抑制作用,因此這些離子對(duì)Cu2+的測(cè)定具有交叉干擾。在上述測(cè)定條件下1 μg/mL 濃度的Cu2+、Hg2+、Ag+對(duì)脲酶的抑制率分別為96.43%、98.54%和100%,三種離子對(duì)脲酶的抑制影響較為相似。為了消除干擾,選擇性檢測(cè)Cu2+,必須對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,提高該生物傳感器選擇性。在溶液中添加某種陰離子,與Hg2+及Ag+生成難溶鹽,是降低它們對(duì)脲酶活性的影響的一種有效途徑。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較,確定NaI 作為一種有效的添加劑來(lái)消除Hg2+和Ag+的影響,加入濃度為5 mmol/L NaI 后,Hg2+和Ag+濃度在1 μg/mL 以內(nèi)均對(duì)脲酶的活性沒(méi)有影響(抑制率<10%)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入的NaI 對(duì)于Cu2+的檢測(cè)靈敏度沒(méi)有明顯的影響。

      2.3 生物傳感器對(duì)Cu2+的檢測(cè)性能

      2.3.1 線性范圍及檢出限

      在最優(yōu)檢測(cè)條件下,不同濃度的Cu2+對(duì)脲酶活性的抑制率如圖3所示,從圖中可以看出,脲酶活性的抑制率隨著Cu2+濃度的增加逐漸增加,在0.005~0.5 μg/mL 的Cu2+濃度范圍內(nèi),脲酶活性的抑制率與Cu2+濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性響應(yīng)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9。以脲酶受到明顯抑制,及抑制率>10%計(jì),該生物傳感器對(duì)Cu2+的檢出限為0.002 μg/mL。當(dāng)Cu2+濃度大于1 μg/mL時(shí),脲酶的活性幾乎完全被抑制(抑制率>95%)。

      2.3.2 生物傳感器的再生及其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

      為了考察所制備的生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,首先要對(duì)生物傳感器的再生進(jìn)行研究。EDTA 是一種高效的Cu2+螯合劑,因此,可以利用EDTA 來(lái)去除與酶活性中心結(jié)合的Cu2+使酶的活性得到恢復(fù),從而使生物傳感器得到再生。實(shí)驗(yàn)研究表明,EDTA 濃度0.5 mmol/L,再生時(shí)間5 min,生物傳感器可以獲得最佳再生效果,酶活性可以恢復(fù)至初始狀態(tài)的95%。

      在上述再生條件,用同一生物傳感器重復(fù)測(cè)定0.5 μg/mL 的Cu2+溶液8次,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%,這一結(jié)果說(shuō)明該生物傳感器具有很好的精密度。

      將新制備的生物傳感器浸泡在4℃,pH6.0的PBS溶液中,通過(guò)每天測(cè)定其對(duì)同一濃度Cu2+溶液的響應(yīng)考察了該生物傳感器的穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該生物傳感器表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性,在30 d 內(nèi)靈敏度沒(méi)有明顯下降。

      圖3 生物傳感器對(duì)Cu2+檢測(cè)的校正曲線Fig.3 Calibration curve for Cu2+determination by the proposed biosensor

      2.3.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

      為了進(jìn)一步考察該生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值,采集了兩份工業(yè)廢水樣品,同時(shí)用所制備的生物傳感器及ICP-MS 進(jìn)行分析對(duì)比,兩種方法對(duì)兩份水樣中Cu2+濃度測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差分別為5.1%和4.2%,兩種方法的測(cè)定值具有很好的一致性,從而證明該生物傳感器能用于實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)。

      3 結(jié)論

      以殼聚糖作為載體,將脲酶固定于pH 電極表面,成功制備出可靈敏檢測(cè)Cu2+的生物傳感器。在樣品溶液中加入NaI,可以消除Hg2+和Ag+對(duì)Cu2+測(cè)定的干擾。同時(shí),該生物傳感器具有良好的再生能力,能重復(fù)利用,且重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高,能用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

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