高效液相色譜法手性固定相拆分手性藥物研究進(jìn)展

李雪，李優(yōu)鑫，張勇

(天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

手性，指化合物具有結(jié)構(gòu)上鏡像對(duì)稱而又不能完全重合的分子，作為自然界生命基礎(chǔ)的生物大分子都具有手性，人們所使用的藥物絕大多數(shù)也具有手性。手性分子兩對(duì)映體具有完全相同的物理、化學(xué)性質(zhì)，但具有不同的藥理活性，手性藥物進(jìn)入人體往往一種對(duì)映體有效而另一種無(wú)效甚至具有毒性。20世紀(jì)60年代，一種稱為反應(yīng)停的孕婦使用的鎮(zhèn)定劑，上市后導(dǎo)致1.2萬(wàn)名嬰兒的生理缺陷，因?yàn)榉磻?yīng)停的右旋體為止吐藥，而左旋體具有強(qiáng)烈的致畸作用。服用單一對(duì)映體的手性藥物，不僅可以避免對(duì)于毒性對(duì)映體的攝入，減輕人體對(duì)于無(wú)效對(duì)映體的代謝負(fù)擔(dān)，還可以提高藥物專一性、減少服藥劑量。因此，手性藥物的分析分離在生物、醫(yī)藥領(lǐng)域一直是研究的熱點(diǎn)。

HPLC作為經(jīng)典實(shí)用的分析方法，被廣泛應(yīng)用于手性藥物的拆分。HPLC分離手性藥物對(duì)映體分為間接法和直接法，間接法又稱為手性試劑衍生化法，直接法分為手性流動(dòng)相添加劑法和CSP法。CSP作為HPLC分離手性藥物中最有效的一種方法，其發(fā)展一直是HPLC分離手性藥物的重點(diǎn)，目前用于手性分離的固定相已經(jīng)有接近100種［1］。根據(jù)手性固定相的不同來(lái)源，可分為天然、半合成和全合成三大類。本文介紹國(guó)內(nèi)外近幾年手性固定相拆分手性藥物的研究進(jìn)展，包括幾種經(jīng)典類型及一些新型手性固定相。

1 幾種經(jīng)典手性固定相的手性藥物拆分

1.1 環(huán)糊精類手性固定相

環(huán)糊精(CD)手性固定相分為化學(xué)鍵合固定相及物理涂覆固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相是將CD或其衍生物通過(guò)共價(jià)鍵鍵合至硅球表面，這類固定相具有耐溶劑且高柱效等優(yōu)點(diǎn)。環(huán)糊精物理涂覆是利用硅膠吸附特性，將CD或其衍生物直接涂覆至裸露的硅球表面，是一種較為簡(jiǎn)單且有效的固定相制作方法［2］，但由于這種方法多用于正相高效液相色譜，因此這方面的研究工作較少，這里主要介紹化學(xué)鍵合手性固定相。

Nikolic等［3］使用中性β-CD化學(xué)鍵合固定相對(duì)藥物有效成分S-氯吡格雷和會(huì)引起不良反應(yīng)的R-氯吡格雷實(shí)現(xiàn)良好分離，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。由于天然CD的手性識(shí)別能力有限，無(wú)法滿足大量不同結(jié)構(gòu)手性藥物的分離，因此多種多樣的衍生化CD被應(yīng)用于手性分離。沈靜茹等［4］以雙［-6-氧-(-3-間硝基苯磺?；?丁二酸-1，4 單酯)-4-］-β-CD 鍵合全多孔硅膠基質(zhì)為高效液相色譜固定相，以正相和反相模式對(duì)藥物撲爾敏進(jìn)行了手性分離。Rao等［5］使用高效液相色譜反相模式及二甲基-β-CD鍵合固定相對(duì)舍曲林手性對(duì)映體及5種相關(guān)手性物質(zhì)進(jìn)行了分離及方法學(xué)驗(yàn)證，此方法足以對(duì)舍曲林進(jìn)行質(zhì)量控制和純度檢測(cè)。目前研究較多的還有帽形(capped)CD，其中CD和其他主體超分子化合物(如冠醚、杯芳烴等)偶聯(lián)起來(lái)，形成一種具有多重識(shí)別位點(diǎn)的主體化合物，其中兩種主體超分子的協(xié)同效應(yīng)增加了對(duì)客體分子的識(shí)別，表現(xiàn)出優(yōu)秀的手性識(shí)別能力和分離選擇性。Zhao等［6］合成利福霉素帽形-(3-(2-O-β-環(huán)糊精)-2-羥基丙氧基)-丙基甲鍵合手性固定相(RCD-HPS)，其具有兩個(gè)手性結(jié)合位點(diǎn):利福霉素和β-CD，對(duì)于華法林等幾種芳香位置異構(gòu)體的手性藥物顯示出良好的分離能力。

1.2 多糖類手性固定相

多糖類手性固定相是將多糖鍵合至硅膠上，通過(guò)在羥基上連接各種不同取代基團(tuán)，得到具有不同手性識(shí)別能力的HPLC固定相。多糖含有眾多的可能作用位點(diǎn)，其手性識(shí)別能力被歸因到具有手性的碳水化合物單體及其螺旋形二級(jí)結(jié)構(gòu)。

目前，多糖類手性固定相是HPLC手性分離中應(yīng)用最為廣泛的一類固定相［7］。Peng等［8］在反相HPLC模式下，利用200余種外消旋體手性藥物，檢測(cè)了20多種多糖衍生化手性固定相的分離能力。Antonina等［9］利用多糖手性固定相分離了特康唑、聯(lián)苯芐唑等10種抗真菌手性藥物對(duì)映體，并根據(jù)改變鍵合有不同類型多糖的HPLC色譜柱、色譜分離溫度、藥物主要成分、流動(dòng)相添加劑等條件，觀察出手性對(duì)映體經(jīng)分離洗脫順序的逆轉(zhuǎn)。Mohamed等［10］使用纖維素手性柱對(duì)血漿及藥物制劑中的克侖特羅進(jìn)行了分離及鑒定，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證證實(shí)該HPLC方法對(duì)該藥物具有高度專一性，可以用于藥物質(zhì)量控制及治療藥物監(jiān)測(cè)。Kazoka等［11］對(duì)兩種吡拉西坦衍生物使用6種多糖手性固定相進(jìn)行了分離，并尋找出了手性識(shí)別能力較高的多糖固定相。通常，在HPLC分離手性藥物時(shí)，在流動(dòng)相中加入少量的添加劑，可以改變分離效果。Mosiashvili等［12］系統(tǒng)研究了在極性有機(jī)流動(dòng)相、多糖類手性柱作為固定相時(shí)，添加酸性或堿性添加劑對(duì)幾種堿性藥物手性分離的影響。

1.3 Pirkle型手性固定相

Pirkle型手性固定相是將單分子層的手性有機(jī)分子通過(guò)適宜的連接基團(tuán)鍵合到硅膠載體上制得的，因而被稱之為“刷型”或“束型”。由于良好的載樣能力，Pirkle型固定相非常適用于臨床前少量藥物的HPLC手性分離制備［13］。

過(guò)去幾年，Pirkle型Whelk-O 1手性固定相在藥物開發(fā)早期解決手性分離工作，在所有商業(yè)可得的Pirkle手性柱中，研究顯示只有Whelk-O 1型對(duì)特殊的活性藥物顯示出了手性異構(gòu)體分離能力。Thomas等［14］發(fā)明了柱耦合方法，提高了Whelk-O 1手性柱的分離效率及應(yīng)用范圍。William等［15］使用4種Pirkle型手性固定相分離一種新型的苯嗎喃類藥物，結(jié)果顯示，僅有Whelk-O 1手性固定相能夠達(dá)到較好分離效果。Karol等［16］使用點(diǎn)擊化學(xué)的方法合成Pirkle-陰離子交換混合型手性固定相，在正相、反相等液相色譜條件下，均基線分離了洛芬類藥物。

1.4 蛋白質(zhì)類手性固定相

蛋白質(zhì)是由氨基酸為單位組成的具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的生物大分子，所有蛋白質(zhì)都具有識(shí)別手性分子的潛力。蛋白質(zhì)類手性固定相的優(yōu)點(diǎn)是在反相液相色譜法中可以用水作為流動(dòng)相，雖然具有良好的手性選擇能力，但較差的穩(wěn)定性和較小的載樣量限制了此類固定相的應(yīng)用。

牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、α-酸性糖蛋白(AGP)是主要用于手性分離的蛋白質(zhì)，它們通過(guò)多種方法被固定在二氧化硅基質(zhì)上，制成HPLC固定相。Stewart等將BSA固定在瓊脂糖基質(zhì)上，作為手性固定相進(jìn)行液相分離［17］。Mallik 等［18］通過(guò)巰基將蛋白質(zhì)及其他配體固定化在二氧化硅填料上制成固定相，其中HAS作為被鍵合的模型蛋白在HPLC中顯示出高親和力，對(duì)手性藥物華法林和布洛芬實(shí)現(xiàn)了良好分離。由于青霉胺紫外吸收強(qiáng)度較弱，Bhushan等［19］以茚三酮作為可逆的標(biāo)記試劑，利用AGP手性固定相進(jìn)行分離，優(yōu)化出了最佳分離條件(分離度超過(guò)2)并進(jìn)行了制備。Akapo等［20］使用AGP手性固定相對(duì)福莫特羅的4種立體異構(gòu)體進(jìn)行了HPLC分析方法的建立和驗(yàn)證。

2 新型手性固定相

雖然目前廣泛應(yīng)用的幾種經(jīng)典手性固定相可以滿足大部分的分離需求，但一些特定結(jié)構(gòu)類型的例如立體中心是非極性［21］的分析物還需要更多新型手性固定相的設(shè)計(jì)。目前已經(jīng)用于手性分離的新型手性固定相有環(huán)果聚糖類手性固定相、金屬?gòu)?fù)合物鍵合手性固定相、含硼手性固定相、離子性液體手性固定相等。環(huán)果聚糖類手性固定相在2009年第1次被Armstrong等報(bào)道使用［22］，其通過(guò)每單位呋喃果糖含有的4個(gè)手性中心與分析物之間的作用［23］識(shí)別手性分子。Perera等［24］利用衍生化環(huán)糊精及環(huán)果聚糖類手性固定相對(duì)17種四氫苯并咪唑衍生物外消旋體實(shí)現(xiàn)良好分離。第1個(gè)在室溫下融化為液體的有機(jī)鹽為乙硝酸銨，與將離子性液體作為流動(dòng)相添加劑來(lái)提高HPLC分離度相比，將離子性液體通過(guò)共價(jià)鍵合到CSP上的文獻(xiàn)報(bào)道較少［25］，而Zhou等開發(fā)出一種將離子性液體鍵合至硅膠上功能化的β-CD手性固定相，分離了16種手性芳香醇衍生物及兩種外消旋體藥物。醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域分析樣品種類增多的同時(shí)，對(duì)手性固定相種類的需求逐漸增大，但要將這些新型手性固定相廣泛應(yīng)用于手性藥物的拆分還有一定的距離。

3 結(jié)束語(yǔ)

總之，固定相與手性藥物對(duì)映體發(fā)生手性識(shí)別作用，則一定有三點(diǎn)相互作用。隨著計(jì)算機(jī)化學(xué)的不斷發(fā)展，與傳統(tǒng)方法相比，CSP的設(shè)計(jì)達(dá)到了更高水平。組合方法與高通量合篩選已用于研制高選擇性的具有手性識(shí)別能力的固定相。數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合擴(kuò)展的自動(dòng)篩選方法學(xué)，再配合多通道微流控HPLC，將提供一個(gè)真正高通量方法，以快速鑒別最有前景的CSP。用CSP法分析分離外消旋手性藥物是一種經(jīng)濟(jì)而有效的途徑，而要得到分離效率高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣的手性固定相，則需要對(duì)手性固定相識(shí)別機(jī)理更深入的研究及科研人員的不懈努力。

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