肺炎克雷伯菌耐藥機制的研究進展*

林華勝 張薇 李國明

肺炎克雷伯菌（KPN）是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌之一。近年來，由于臨床上抗菌藥物的大量應(yīng)用和濫用，致使KPN耐藥率居高不下，直接影響到臨床治療效果。Amazian等[1]研究顯示，肺炎克雷伯菌占地中海地區(qū)醫(yī)院內(nèi)感染的9.2%；2011年全國醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)醫(yī)院感染病原菌分布調(diào)查顯示KPN占9.03%，成為國內(nèi)醫(yī)院感染的第二大病原菌[2]。國外曾經(jīng)報道一組由多重耐藥KPN引起醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行，死亡率高達40%[3]。KPN主要耐藥機制包括產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶、藥物作用靶位的改變、抗菌藥物滲透障礙（生物被膜、外膜孔蛋白缺失）、主動外排泵系統(tǒng)的亢進作用等，同時抗菌藥物耐藥基因借助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子的播散也是耐藥菌株臨床加劇的重要原因。本文對上述耐藥機制的研究進展作一簡要綜述。

1 產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶

細菌可產(chǎn)生許多能引起抗菌藥物滅活的酶，主要包括β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶（AME）。KPN對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要機制之一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。它可通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，使β-內(nèi)酰胺類藥物水解從而失去抗菌活性，其水解率是細菌耐藥性的主要決定因素。KPN產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶主要包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶、耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶（IRBLs）及碳青霉烯酶（KPC酶）等。

1.1 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）ESBLs是KPN耐藥產(chǎn)生的最主要的一類酶。1983年由德國報告了世界上第一例ESBLs，1994年在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)現(xiàn)國內(nèi)首例ESBLs感染，迄今已報告的ESBLs的代表菌株有肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等。ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸蛋白衍生物，通過水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶，導(dǎo)致此類抗菌藥物耐藥，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸鉀所抑制，但羅燕萍等[4]報道，產(chǎn)ESBLs的PKN對酶抑制劑復(fù)合抗生素也有較高的耐藥率。

ESBLs以TEM型和SHV型最常見，CTX-M型是我國的主要基因型。TEM型ESBLs主要對青霉素、氨芐西林及頭孢他啶等一代頭孢菌素耐藥，但對頭孢噻肟敏感，對舒巴坦和克拉維酸耐藥是所有CTX-M型酶的特點。SHV型ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)或染色體編碼產(chǎn)生，主要引起細菌對第一代頭孢菌素和青霉素耐藥，SHV-1型對阿莫西林、氨芐西林等青霉素類抗菌藥物有較強的水解作用。目前用于治療產(chǎn)ESBLs菌所致感染的藥物有碳青霉烯類、頭霉素類抗生素，亞胺培南具有超廣譜、高效的抗菌活性，是治療ESBLs菌感染的首選藥物。

1.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶 AmpC酶由AmpC基因編碼產(chǎn)生，AmpC基因表達同時受AmpD、AmpR、AmpG等多種基因的調(diào)控。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶是由位于腸桿菌屬、假單胞菌屬及沙雷菌屬等菌屬染色體上的AmpC基因通過基因轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)到KPN的質(zhì)粒上，伴隨細菌復(fù)制而編碼產(chǎn)生，其容易引起KPN或大腸埃希菌對第三代頭孢菌素或酶抑制劑的耐藥[5]。自1988年發(fā)現(xiàn)首例質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶MRI-1，迄今已有40余種基因型，世界范圍內(nèi)以CMY-2型多見，國內(nèi)主要為DHA-1型和ACT-1型，多在克雷伯菌、大腸埃希菌和沙門菌等菌屬中呈持續(xù)高表達狀態(tài)傳播。近年還發(fā)現(xiàn)AmpC酶不僅由染色體介導(dǎo)，也可由質(zhì)粒介導(dǎo)，且質(zhì)粒介導(dǎo)者因其具有較快的傳播速度和較強的耐藥性，導(dǎo)致耐藥性的廣泛傳播，這都成為臨床抗感染治療較棘手的問題[6]。

質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶與ESBLs的區(qū)別在于前者能水解第3代頭孢菌素類、單環(huán)內(nèi)酰類和頭霉素類（附ACC1外），而且不受酶抑制劑的抑制作用，對類碳青霉烯類藥物或第4代頭孢菌素敏感。但Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，缺失一種39×103大小的外膜蛋白的產(chǎn)DHA-1的KPN對碳青霉烯類藥物的敏感性出現(xiàn)不同程度的降低。Bidet等[8]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ACC1的KPN在缺失一種36×103大小的外膜蛋白后，對亞胺培南產(chǎn)生了耐藥性。

1.3 耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶（IRBLs）IRBLs是一種不受酶抑制劑所抑制的β-內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分子分類的A類、Bush功能分類的2br亞類，TEM型是主要來源，由TEM-1、TEM-2、SHV-1基因發(fā)生突變形成，其他還有SHV-10、SHV-49、OXY-2以及OXA型的β-內(nèi)酰胺酶等。KPN對酶抑制劑的主要耐藥機制是由質(zhì)粒介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶基因特別是TEM-1基因發(fā)生突變后，產(chǎn)生了TEM型β-內(nèi)酰胺酶而引起對酶抑制劑耐藥。其特點容易導(dǎo)致KPN對阿莫西林、替卡西林及其酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦及其復(fù)合抗生素耐藥，但對窄譜頭孢菌素、7-α-甲氧基頭孢菌素和氧亞氨基頭孢菌素敏感。

1.4 碳青霉烯酶（KPC酶）KPN對碳青霉烯類最主要的耐藥機制的是產(chǎn)生KPC酶，它能水解包含碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，而且絕大多數(shù)對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑具有抗性。這些酶以產(chǎn)KPC酶為主，主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，包括Ambler分類的A、D類KPC酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶。KPN容易引起碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類、青霉素類或單環(huán)類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

KPC酶最早由Yigit等[9]于2001年在美國北卡羅來納州的KPN中發(fā)現(xiàn)，屬于KPC-1型；國內(nèi)于2006年首次報道在一株KPN中檢測到KPC-2。至今已發(fā)現(xiàn)的KPC酶有KPC-1~11共11種類型，其中以KPC-2和KPC-3在臨床分離菌株中最為常見，且是引起大多數(shù)爆發(fā)流行的主要類型[10]。2005年和2011年在美國先后發(fā)生了碳青霉烯類抗生素耐藥的KPN流行[11-12]。我國2010年CHINET耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，KPN對碳青霉烯類的耐藥率為10%，由此可見KPC酶介導(dǎo)的耐藥將成為KPN耐藥的重要機制之一[13]。

另外，KPN也會產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶（AME），這是引起細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要機制。

2 藥物作用靶位的改變

在KPN中，編碼拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的parC基因及編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA基因靶位出現(xiàn)變異時，這兩類酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象容易發(fā)生變化，致使酶-DNA復(fù)合物與抗菌藥物不能穩(wěn)定結(jié)合，達不到干擾細菌DNA合成的作用，最終引起KPN對喹諾酮類耐藥。gyrA基因變異在基因靶位的變異中起主導(dǎo)作用，位于gyrA的絲氨酸Ser83和天冬氨酸Asp87，絲氨酸Ser80和parC的谷氨酸Glu84是最常見變異位點。高山等[14]研究應(yīng)證了第83位氨基酸的改變是喹諾酮類耐藥的主要原因。

質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnr是另一種耐藥機制，其通過編碼蛋白與拓撲異構(gòu)酶Ⅳ進行特異性結(jié)合，減少喹諾酮類藥物的作用靶位從而產(chǎn)生細菌耐藥。李娟等[15]報道，在37株KPN中檢測到有7株攜帶qnrS基因，且全部具有多重耐藥性，只有對亞胺培南敏感。

3 抗菌藥物滲透障礙

3.1 生物被膜（BF）BF是細菌吸附在機體腔道黏膜表面，通過分泌多糖蛋白復(fù)合物包繞而形成的膜狀物。BF可通過物理阻擋作用阻止外來大分子物質(zhì)的滲入，同時與抗菌藥物結(jié)合制約其進入到細菌生物被膜內(nèi)部，最終導(dǎo)致細菌接觸到的抗菌藥物濃度過低產(chǎn)生耐藥。Anderl等[16]通過用10倍MIC濃度的氨芐西林對抗浮游生長和生物被膜狀態(tài)的KPN，證明BF可以阻止藥物滲入而使氨芐西林產(chǎn)生耐藥性。Yang等[7]還發(fā)現(xiàn)BF菌的特殊結(jié)構(gòu)和生理特性使菌體內(nèi)抗菌藥物濃度明顯降低，有更多機會誘導(dǎo)浮游生長菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而引起耐藥。

3.2 外膜孔蛋白缺失 KPN等革蘭陰性菌細胞外膜脂多層中存在由許多微孔蛋白組成的孔道，它是一種非特導(dǎo)性的、跨越細胞膜的水溶性擴散通道，一些β-內(nèi)酰胺酶類藥物可經(jīng)通道進入菌體內(nèi)而發(fā)揮作用。若微孔蛋白發(fā)生改變或缺失，抗菌藥物將難以滲入細菌胞內(nèi)而出現(xiàn)耐藥。氨基糖苷類等抗菌藥物因尚有其他通道進入，故影響不大。

KPN的孔蛋白最常見發(fā)生耐藥是OmPK35，其他還有OmPK36、OmPK37等?？椎鞍椎母淖冊黾蛹毦退幮?，與滅活酶并存時的耐藥程度比滅活酶單獨作用時高。Webster等[18]報道，OmpK35和OmpK36的缺失可導(dǎo)致KPN對美羅培南耐藥。

4 主動外排泵系統(tǒng)的亢進作用

在KPN的內(nèi)膜上存在能量依賴性蛋白外排泵的外排系統(tǒng)，能主動將滲入細菌體內(nèi)的的藥物不斷泵出。當細菌體內(nèi)某種調(diào)節(jié)機制發(fā)生改變，導(dǎo)致主動外排系統(tǒng)表達亢進，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導(dǎo)致耐藥。這是KPN產(chǎn)生多重耐藥的重要機制之一。由于這種系統(tǒng)是非專一性的，廣泛包括內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物在內(nèi)的外排底物，往往多種主動外排系統(tǒng)并存于同一株細菌，因此可導(dǎo)致細菌對各種完全不同結(jié)構(gòu)的抗菌藥物的產(chǎn)生耐藥。馬建新等[19]和彭少華等[20]研究發(fā)現(xiàn)，多藥耐藥KPN抗菌制劑外排泵基因攜帶率較高。

5 整合子

整合子是由Hall于1989年首次發(fā)現(xiàn)提出的概念。它是一種能被識別和俘獲的外源性可移動基因，其位于細菌的質(zhì)?；蛉旧w上，是攜帶編碼抗菌藥物耐藥基因盒的DNA片斷，它具有位點特異性的基因重組系統(tǒng)。研究表明，整合子不僅能通過介導(dǎo)細菌耐藥性群聚而產(chǎn)生多重耐藥性，而且可在菌種和不同遺傳物質(zhì)間轉(zhuǎn)移，引起耐藥基因快速廣泛播散[21]。整合子作為遺傳的基因元件普遍存在革蘭陰性菌中，根據(jù)整合酶基因同源性主要分4類，與細菌耐藥性密切相關(guān)主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子。其中Ⅰ類整合子在臨床分離菌株中分布最廣泛，由 5′ 保守區(qū)（5′ CS）、3′ 保守區(qū)（3′ CS）和兩者之間的可變區(qū)3個部分組成，其攜帶的耐藥基因盒包括對氨基糖苷類、磺胺、喹喏酮類和消毒劑等130多種，其編碼產(chǎn)物可賦予細菌對全部臨床常用藥物種類產(chǎn)生耐藥，因此Ⅰ類整合子是目前整合子研究的熱點。研究表明，細菌1個整合子同時能夠捕獲多個基因盒表達出對不同抗菌藥物的多藥耐藥性，而整合子內(nèi)部包含某些ESBLs編碼基因更易促使攜帶整合子的產(chǎn)ESBLs菌株表達出擴散優(yōu)勢。研究證明，在產(chǎn)ESBLs的KPN中已經(jīng)相當普遍存在Ⅰ類整合子[22-23]。Ⅱ類整合子在細菌中分布比較為局限，主要分布在志賀菌屬中，大腸埃希菌、變形菌屬、沙門菌屬等也曾發(fā)現(xiàn)。李濤等[24]從98株KPN中檢出攜帶Ⅱ類整合酶基因的陽性率僅為1%，提示KPN中Ⅱ類整合子的攜帶率較低。Ⅲ類整合子至今檢出極少。

6 結(jié)語

綜上所述，由于微生物等對藥物耐藥性的廣泛出現(xiàn)，使抗感染治療重新成為一個棘手的問題。KPN作為一種條件致病菌所引起的感染在細菌感染性疾病中的比重日漸增加，其耐藥機制非常復(fù)雜多變，抗菌藥物對其產(chǎn)生的耐藥性日趨嚴重，許多領(lǐng)域仍亟待更深一步的探索研究。在臨床治療中，醫(yī)務(wù)工作者要逐步掌握細菌的耐藥特性，研制并合理、有效使用抗生素，提高抗感染的成功率。

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