維生素D受體基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的關(guān)聯(lián)研究*

劉蒙趙龍鳳

維生素D受體基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的關(guān)聯(lián)研究*

劉蒙①趙龍鳳①

目的：探討維生素D受體（VDR）FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者臨床表型的關(guān)聯(lián)。方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)檢測VDR FokⅠ基因的多態(tài)性在44例慢性乙型肝炎重度患者、46例中度患者和40例非活動性HBsAg攜帶者中的分布，并進(jìn)行基因型分析。結(jié)果：慢性乙型肝炎重度組、慢性乙型肝炎中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對照組（非活動性HBsAg攜帶者）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；慢性乙型肝炎重度組、中度組與對照組VDR FokⅠ基因酶切位點(diǎn)的等位基因F/f分布存差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關(guān)性。慢性乙型肝炎重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對照組。結(jié)論：VDR FokⅠ基因的多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在一定的關(guān)系。

慢性乙型肝炎； 維生素D受體； 基因多態(tài)性； 免疫調(diào)節(jié)

慢性乙型肝炎（CHB）是以肝細(xì)胞損傷和肝組織炎性反應(yīng)為主的疾病，乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝損傷及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的細(xì)胞免疫密切相關(guān)，主要以T淋巴細(xì)胞清除病毒和肝細(xì)胞的損傷為主[1]。1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]是維生素D3的活性形式[2]。隨著研究的深入，人們認(rèn)識到它除了調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，還具有介導(dǎo)免疫反應(yīng)作用，而這些功能的實現(xiàn)主要是由維生素D受體（ vitamin D receptor， VDR）來介導(dǎo)的[3]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）的方法，初步探討VDR基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者不同臨床表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月-11月本院感染科住院的慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者90例，其中重度患者44例，男26例，女18例，平均年齡（37.4±12.5）歲；中度患者46例，男29例，女17例，平均年齡（35.4±10.5）歲。對照組選擇同期本院感染科住院和門診的非活動性HBsAg攜帶者40例，其中男27例，女13例，平均年齡（32.5±9.2）歲，全部患者均為生活在本地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版”，所有患者在3個月內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒藥物，并排除合并其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化及肝癌等。全部患者均自愿參加本次研究。三組研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查 肝功能相關(guān)指標(biāo)，包括AST/ALT、血清總膽紅素TBIL、凝血酶原活動度PTA、血清白蛋白；檢測HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc及HBVDNA滴度。

1.2.2 基因組DNA的提取 留取慢性乙型肝炎中度及重度患者和非活動性HBsAg攜帶者空腹12 h后，晨起靜脈采血4 mL（EDTA抗凝），采用硅膠柱純化方式，用血液DNA提取試劑盒（D3741-01 美國OMEGA），從700 μL抗凝血液中提取淋巴細(xì)胞基因組DNA。利用UV計測定所提取的DNA濃度及純度，并將其稀釋至10 ng/μL，分裝保存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCRRFLP） VDR FokⅠ基因的引物序列：上游引物，5，-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3；下游引物，5，-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3?？偡磻?yīng)體系均為25 μL：1 μL基因組DNA，2.5 μL 10×PCR 緩沖液，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 2 μL，0.25 μL Taq DNA 聚合酶，去離子水18.25 μL。VDR FokⅠPCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。取擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物0.5 μL，1 μL限制性內(nèi)切酶FokⅠ，及2 μL 10×M Buffer， 2 μL 0.1% BSA（由大連TaKaRa公司提供）及14.5 μL滅菌水組成酶切總反應(yīng)體系20 μL，置于37 ℃水浴1 h，進(jìn)行FokⅠ酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以DL700 Marker為參考，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 比較慢性乙型肝炎現(xiàn)癥患者重度組、中度組和對照組VDR基因多態(tài)性的差異；VDR FokⅠ基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎不同病情程度的關(guān)聯(lián)程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 分別統(tǒng)計CHB現(xiàn)癥患者重度組、CHB現(xiàn)癥患者中度組和對照組非活動性HBsAg攜帶者基因型和等位基因的分布頻率數(shù)據(jù)，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，P＞0.05認(rèn)為資料可靠，代表性好。計數(shù)資料采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果電泳圖譜 VDR FokⅠ酶切后出現(xiàn)3種結(jié)果：純合子FF為270 bp，1條帶；雜合子Ff為270 bp、195 bp，2條帶；純合子ff為195 bp，1條帶，見圖1。

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果電泳圖譜

2.2 VDR FokⅠ基因的基因型和等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗后，結(jié)果顯示符合Hardy-Weinberg平衡，說明資料可靠，代表性好。CHB重度組、中度組VDR FokⅠ基因的基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=34.816，P＜0.01）。見表1。CHB重度組、中度組患者與對照組VDR FokⅠ基因酶切位點(diǎn)的等位基因F/f分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=50.674，P＜0.01），Pearson列聯(lián)系數(shù)=0.53，提示等位基因F/f分布與慢性乙型肝炎患者的不同臨床表型存在相關(guān)性。CHB重度組、中度組f等位基因分布頻率高于對照組，見表1。

3 討論

VDR基因定位于12號染色體長臂，其包含有11個外顯子，在基因組上總長為75 Kb，VDR包含427個氨基酸殘基，分子量為50 KD[4]。目前報導(dǎo)的VDR基因多態(tài)性與4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有關(guān)，分別為2號外顯子的FokⅠ位點(diǎn)、第8內(nèi)含子的BsmⅠ位點(diǎn)、ApaⅠ位點(diǎn)及第9外顯子的TapⅠ位點(diǎn)。近年來，人們逐漸認(rèn)識到VDR的基因多態(tài)性除了參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，其有著更廣泛的生理作用，如：抗增殖、抗分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)免疫反應(yīng)及多種內(nèi)分泌腺激素的分泌，調(diào)節(jié)造血組織造血等作用[5-6]。

表1 CHB患者VDR基因的FokI酶切位點(diǎn)多態(tài)性及其等位基因分布頻率的分析

研究證明，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞這兩種細(xì)胞亞型參與了免疫介導(dǎo)性肝炎的發(fā)病機(jī)制。Treg細(xì)胞為體內(nèi)致免疫耐受的主要細(xì)胞，其有效控制病原體的T細(xì)胞反應(yīng)，而Th17細(xì)胞主要通過產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-17可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，這兩種細(xì)胞亞型在特定的某些細(xì)胞因子等因素的作用下，可相互轉(zhuǎn)換，相互制約[7-9]。Sneha等[10]研究發(fā)現(xiàn)1，25-（OH）2D3可以通過阻礙IL-17轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子（NF-AT）復(fù)合體的形成，從而抑制IL-17的分泌，進(jìn)而減輕Th17細(xì)胞介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)。另有研究表明，1，25-（OH）2D3及其類似物通過作用于樹突狀細(xì)胞的nVDR，抑制了樹突狀細(xì)胞的成熟，使其處于未成熟狀態(tài)，因此其不能激活初始T細(xì)胞，進(jìn)而使免疫反應(yīng)不能繼續(xù)[11-12]。目前認(rèn)為，不成熟樹突狀細(xì)胞可分泌TGF-b和/或IL-10來誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加Treg細(xì)胞的水平，提高了機(jī)體的免疫耐受性[13-14]。

本實驗結(jié)果顯示，CHB重度組、中度組患者的f等位基因分布頻率高于對照組，提示等位基因f分布頻率的提高可能與CHB的炎癥再活動存在一定的關(guān)系。有研究表明，VDR基因FokⅠ多態(tài)性的C-T替換（F等位基因-f等位基因），造成潛在的起始位點(diǎn)，f等位基因編碼的VDR增加了3個氨基酸，f等位基因的轉(zhuǎn)錄效率比F等位基因降低了1.7倍，故ff基因型的個體，其VDR表達(dá)量較低，可能導(dǎo)致使ff基因型結(jié)合1，25-（OH）2D3的能力降低，進(jìn)而使其介導(dǎo)的免疫耐受反應(yīng)減弱，從而使慢乙肝患者所受的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的傷害從一定程度上有所增強(qiáng)[15-16]。由此推測，等位基因f分布頻率的提高可能會促進(jìn)慢性乙型肝炎患者炎癥的再活動。

VDR的基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎的病情發(fā)展程度有一定的關(guān)系，ff基因型的慢性乙型肝炎患者其炎癥再活動的可能性更大，且它極可能是通過影響個體的免疫功能而致病，這為更進(jìn)一步實驗，了解慢性乙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)制及慢性乙型肝炎的基因治療提供了有價值的理論依據(jù)。

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Association of Vitamin D Receptor Gene FokⅠ Polymorphisms with Chronic Hepatitis B Patients

LIU Meng，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：022-024

Objective：To investigate the association of vitamin D receptor gene FokⅠ polymorphisms with the clinical phenotype of chronic hepatitis B patients.Method：The genotype of vitamin D receptor gene FokⅠ of 44 heavy degree chronic hepatitis B patients，46 moderate degree chronic hepatitis B patients and 40 non-active HBsAg carriers were tested by polymerase chain react ion-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.Result：There were significant differences in FokI genotypes among heavy degree，moderate degree chronic hepatitis B patients and non-activeHBsAg carriers（P＜0.01）； There were significant difference in the frequence of allel F/f among heavy degree，moderate degree chronic hepatitis B patients and non-active HBsAg carriers（P＜0.01）， Pearson C=0.53 and the frequency of alleles f in the two groups was significantly higher than that in non-active HBsAg carriers。Conclusion：Vitamin D receptor gene polymorphisms have an relationship with the clinical phenotype of chronic hepatitis B patients.

Chronic hepatitis B； Vitamin D receptor； Genetic polymorphism； Immunoregulatory

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.008

2014-01-26） （本文編輯：黃新珍）

山西省科技攻關(guān)項目（201103113012-4）；山西省科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目（2012091007）

①山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 山西 太原 030001

趙龍鳳

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China