蟾酥注射液對(duì)仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護(hù)作用試驗(yàn)

帥學(xué)宏，胡庭俊，曾 蕓，黃 明，馮世文，賴勝基

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530005）

豬大腸桿菌病是由豬致病性大腸桿菌引起的一種急性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。蟾酥是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，具有多種藥效，尤其在抗腫瘤方面的研究報(bào)道較多[1-2]。但關(guān)于其抗菌方面的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)仔豬預(yù)先注射蟾酥注射液，然后采用致病性大腸桿菌進(jìn)行攻毒，觀察受試豬的腹瀉情況，并且測(cè)定豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化，從而評(píng)價(jià)蟾酥注射液是否對(duì)仔豬致病性大腸桿菌感染具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品試劑 蟾酥注射液（廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)∶20110101）；穿心蓮注射液（廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)∶20091102）；大腸桿菌（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，型號(hào)∶C83901）；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20100305和20100501）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 14～21日齡杜長(zhǎng)大三元雜交仔豬，公母兼?zhèn)?，體重相近、臨床健康。

1.2 方法

1.2.1 蟾酥注射液對(duì)仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護(hù)試驗(yàn) 將60頭仔豬隨機(jī)分為6組，每組10頭，分組及處理如下：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（為高、中、低劑量組）：分別按體重0.2mL/kg，0.1mL/kg，0.05mL/kg的劑量肌肉注射蟾酥注射液，1次/d，連用3 d；Ⅳ（藥物對(duì)照組）：按0.2mL/kg體重肌肉注射穿心蓮注射，1次/d，連用3d；Ⅴ（感染不給藥組）：按0.2mL/kg體重肌肉注射生理鹽水，1次/d，連用3 d，以上5組的仔豬于第4天分別肌肉注射4.0mL大腸桿菌液（3×109CFU/mL）；Ⅵ（空白對(duì)照組）：不給藥，不攻毒。自攻毒后，觀察發(fā)病頭數(shù)，腹瀉情況，從發(fā)病仔豬糞便中采樣分離細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，連續(xù)14 d，試驗(yàn)前后對(duì)受試豬稱重。

1.2.2 T淋巴細(xì)胞標(biāo)記試驗(yàn) 分別在給藥前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔靜脈無(wú)菌采血，新鮮血液涂片，冷風(fēng)立即吹干，冷丙酮-甲醛固定，37℃孵育2 h，孔雀石綠復(fù)染10 s，光鏡下觀察記數(shù)，T淋巴細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒。T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率=T淋巴細(xì)胞數(shù)/200個(gè)白細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 分別在給藥前、攻毒前及攻毒后第4天，前腔靜脈無(wú)菌采血，抗豬淋巴細(xì)胞CD4+（7421224，LgG2b）單克隆抗體，為FTTC標(biāo)記；抗豬淋巴細(xì)胞CD8+（7622211，LgG2a）單克隆抗體，為Biotin標(biāo)記。EPICS2XL流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 蟾酥注射液對(duì)仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護(hù)作用 攻毒后，從發(fā)病豬腸內(nèi)容物分離細(xì)菌后經(jīng)生化鑒定有該大腸桿菌存在。蟾酥注射液不同劑量組、藥物對(duì)照組的保護(hù)率與感染不給藥組比較差異均極顯著（P＜0.01）。高、中劑量組與低劑量組比較差異顯著（P＜0.05），藥物對(duì)照組與低劑量組差異不顯著（P＞0.05）。增重方面，3種蟾酥注射液劑量組、藥物對(duì)照組與感染不給藥對(duì)照組比較差異均極顯著（P＜0.01）；藥物對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）；高、中劑量組與低劑量組比較差異顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 蟾酥注射液對(duì)仔豬人工感染致病性大腸桿菌的保護(hù)作用試驗(yàn)

2.2 T淋巴細(xì)胞標(biāo)記測(cè)定結(jié)果 攻毒前，蟾酥注射液不同劑量組及穿心蓮注射液藥物對(duì)照組的T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與給藥前比較均有升高，感染不給藥組及空白對(duì)照組上升不明顯。攻毒后第4天，蟾酥注射液不同劑量組的T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與接種細(xì)菌前比較還有小幅度升高，感染不給藥組有較大幅度的降低，穿心蓮注射液藥物對(duì)照組及空白對(duì)照組有下降趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 蟾酥注射液對(duì)仔豬T淋巴細(xì)胞標(biāo)記試驗(yàn)

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定結(jié)果 與感染不給藥組相比，高、中劑量蟾酥注射液在首次用藥后第4天均能顯著升高豬外周血CD4+細(xì)胞所占百分比（P＜0.05）。攻毒后第4天，感染不給藥組豬外周血CD4+細(xì)胞所占百分比與陰性對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05）；蟾酥注射液高、中、低劑量組豬外周血CD4+細(xì)胞所占百分比仍維持在較高水平，與感染不給藥組相比較差異極顯著（P＜0.01）。藥物對(duì)照組豬外周血CD4+細(xì)胞所占百分比在攻毒后第4天與感染不給藥組相比差異顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌引起的一類仔豬腸道傳染性疾病，是仔豬的一種常見(jiàn)病和多發(fā)病。該病已逐漸成為影響?zhàn)B豬業(yè)健康快速發(fā)展的重要因素之一。此病主要危害2～3周齡仔豬，臨床特征是排出灰白色的漿糊樣稀便，黏膩腥臭，排便次數(shù)不等。病豬消瘦，發(fā)育遲緩。本試驗(yàn)將大腸桿菌按3×109CFU/mL×4mL/頭的劑量給仔豬攻毒，成功的誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生腹瀉。

表3 蟾酥注射液對(duì)豬外周血CD4+和CD8+細(xì)胞所占百分比的影響 （Mean±SD,n=5,單位：%）

蟾酥藥理活性強(qiáng)，具有抗腫瘤、強(qiáng)心、升壓、興奮呼吸、增強(qiáng)免疫力等作用[3]。蟾酥能提高小鼠免疫功能，增強(qiáng)小鼠脾臟溶血空斑形成細(xì)胞活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能以及增高血清溶菌酶滴度等[4]。蟾酥增強(qiáng)機(jī)體免疫功能在醫(yī)學(xué)上已被證實(shí)，在動(dòng)物體上也有研究[5]。有報(bào)道蟾酥對(duì)活體家兔體內(nèi)大腸桿菌抑制作用[6]。本試驗(yàn)中，對(duì)仔豬預(yù)先注射了不同劑量的蟾酥注射液后，再用大腸桿菌攻毒，仔豬的腹瀉率顯著降低，并且蟾酥注射液劑量越高，保護(hù)的效果越好，低劑量組效果較差，可能是由于用藥劑量不足。說(shuō)明蟾酥注射液對(duì)此日齡段仔豬由大腸桿菌引起的腹瀉有一定的保護(hù)功能，可提高仔豬的抗病力。

T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育后移行至外周淋巴組織，與某種特異性抗原或細(xì)胞相互接觸時(shí)，發(fā)揮免疫功能，在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)中均有重要作用[7]。T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率反映T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，很好反映機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能的高低和評(píng)價(jià)抗病力的強(qiáng)弱[8]。連用3 d蟾酥注射液后可提高T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率，攻毒后第4天不同劑量蟾酥注射液組的T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與攻毒前比較有小幅度升高，感染不給藥組則有較大幅度的降低。結(jié)果表明，蟾酥注射液對(duì)仔豬T淋巴細(xì)胞的增殖有顯著的促進(jìn)作用。

T淋巴細(xì)胞表面抗原CD4+、CD8+分別是輔助性T細(xì)胞及殺傷性T細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志。CD4+淋巴細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，具有輔助T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞，輔助B淋巴細(xì)胞生成抗體等作用，起到誘導(dǎo)和輔助細(xì)胞和體液免疫的作用，稱為輔助T細(xì)胞[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蟾酥注射液可顯著刺激豬CD4+細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)豬的非特異性免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫功能，使機(jī)體處于保護(hù)性免疫應(yīng)答狀態(tài)，從而對(duì)豬致病性大腸桿菌感染具有保護(hù)作用。

4 結(jié)論

適當(dāng)劑量的蟾酥注射液對(duì)人工感染豬致病性大腸桿菌具有保護(hù)作用，能增強(qiáng)豬的細(xì)胞免疫功能，臨床上可用于預(yù)防仔豬大腸桿菌感染，推薦劑量為0.1mL/kg體重，肌肉注射，1次/d，連用3 d。

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