牛乳樣本中布魯菌的核酸檢測及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

白 璧，余彬輝，方 英，藺俐仲，徐春志，楊 峰，陳 紅，彭 屹，袁翠霞

（1.貴陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽550081；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州310000；3.貴陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，貴州 貴陽550081）

布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）侵入機(jī)體引起的重要人畜共患病。該病廣泛分布于世界各地，我國也有著廣泛的流行區(qū)域，較為嚴(yán)重的是近年來布魯菌病發(fā)病呈上升趨勢[1]。據(jù)報(bào)道，截止2009年全國29個(gè)?。▍^(qū)、市）發(fā)生畜間布魯菌病，牛、羊、豬感染達(dá)百萬頭之多，人間布魯菌病2009年全年新增病例3.7萬例，世界范圍內(nèi)每年出現(xiàn)約50萬例人間布魯菌病[2]。由于該病危害大、流行廣，不僅影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，也嚴(yán)重威脅人類健康，是目前世界上嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[3]。

目前，布魯菌病的防控措施主要以撲殺和疫苗免疫接種為主，但由于接種布魯菌病疫苗均為弱毒活疫苗，對(duì)人體健康具有一定的危害作用。本試驗(yàn)為了掌握奶牛接種布魯菌活疫苗后是否通過乳汁排菌，采用套式PCR方法對(duì)某接種過疫苗的奶牛場牛乳進(jìn)行檢測，并對(duì)檢測為陽性的牛乳樣本進(jìn)行了豬種和牛種布魯菌的鑒別及病原菌分離，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 牛乳樣本 234份牛乳樣本采自貴陽市某接種過S2株布魯菌活疫苗的規(guī)?；膛?。

1.2 菌種和主要試劑 S2株布魯菌活疫苗和A19株牛流產(chǎn)布魯菌活疫苗，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；SDS、蛋白酶K、酚/氯仿/異戊醇、dNTP、Taq DNA聚合酶、200 bp DNAMarker、布氏瓊脂、放線菌酮、萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽等試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物的合成 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)》（NY/T 1467-2007），針對(duì)布魯菌外膜蛋白25基因（OMP25）合成兩對(duì)特異性引物Bp1/Bp2和Bp3/Bp4，預(yù)期擴(kuò)增長度419 bp；參照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院李艷等[4]發(fā)表的文獻(xiàn)，針對(duì)布魯菌外膜蛋白2基因（OMP2）合成兩對(duì)特異性引物S1/S2（檢測豬種布魯菌，預(yù)期擴(kuò)增長度535 bp）和A1/A2（檢測牛種布魯菌，預(yù)期擴(kuò)增長度285 bp），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：

Bp1：5，-CGTGCCGCAATTACCCTC-3；

Bp2：5，-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3；

Bp3：5，-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3；

Bp4：5，-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3；

S1：5，-GGCGGCGACGACGTTTAT-3；

S2：5，-CCGGGTCATAGGCAACAG-3；

A1：5，-GGCGATTTCAGCGATGAT-3；

A2：5，-GAACCGGTCGGTGATGTT-3。

1.4 布魯菌總DNA的提取 取牛乳樣本500μL，分別加入SDS和蛋白酶K至終濃度為5 g/L、200μg/mL，56℃水浴1 h；加等體積酚/氯仿/異戊醇，反復(fù)顛倒數(shù)次，12 000 r/min離心10min；取上清，加等體積氯仿/異戊醇，反復(fù)顛倒混勻，12 000 r/min離心10min；取上清，加1/10體積醋酸鈉（NaAc）和2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇，-20℃靜置2 h，12 000 r/min離心10min；棄上清，70%乙醇洗滌并干燥后，適量緩沖液（TE）溶解備用。

1.5 PCR擴(kuò)增 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》（NY/T 1467-2007）中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行，同時(shí)以S2株布魯菌活疫苗作為陽性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。

1.6 布魯菌種的鑒別 參照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院李艷等發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行豬種和牛種布魯菌鑒別。

1.7 布魯菌病原分離 制備1 000mL（含10%馬血清）布氏瓊脂，向其中無菌添加放線菌酮100 mg、萬古霉素25 000 IU、多粘菌素B 6 000 IU和桿菌肽25 000 IU，制備布魯菌選擇性培養(yǎng)基。取PCR檢測為陽性的牛乳樣本在布氏瓊脂平板上直接劃線分離病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 牛乳樣本布魯菌的核酸檢測結(jié)果 采用SDS-蛋白酶K法提取的牛乳DNA樣本以套式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果：234份牛乳樣本經(jīng)套式PCR擴(kuò)增后，其中18份樣本擴(kuò)增出一條419 bp的DNA條帶，與S2株布魯菌活疫苗的擴(kuò)增片段相一致，而滅菌雙蒸水顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。即在奶牛接種過S2株布魯菌活疫苗后乳汁中布魯菌核酸檢出率為7.69%（18/234）。

圖1牛乳樣本的PCR擴(kuò)增

2.2 布魯菌種的鑒別結(jié)果 取上述18份布魯菌核酸陽性乳DNA樣本，分別以S1/S2和A1/A2引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以S2株布魯菌活疫苗、A19株牛流產(chǎn)布魯菌活疫苗作為陽性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。在18份布魯菌核酸陽性乳樣本中，9份樣本S1/S2引物擴(kuò)增出一條535 bp的DNA條帶，系檢出豬種布魯菌核酸；其中1份樣本S1/S2、A1/A2引物分別擴(kuò)增出535 bp和285 bp的DNA條帶，系牛流產(chǎn)布魯菌與豬布魯菌核酸的混合物；其余9份樣本未擴(kuò)增出任何DNA帶，PCR檢測顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 S1/S2引物PCR擴(kuò)增

圖3 A1/A2引物PCR擴(kuò)增

2.3 布魯菌病原分離結(jié)果 取18份布魯菌核酸陽性牛乳樣本在布氏瓊脂平板上直接劃線分離病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)數(shù)天，未觀察到布魯菌生長。

3 討論

3.1 目前，布魯菌病的檢測技術(shù)主要是血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，由于本次試驗(yàn)所檢測的樣本局限于牛乳，而血清學(xué)方法中的全乳環(huán)狀試驗(yàn)所需樣本受初乳、泌乳后期乳、腐敗變質(zhì)乳、患乳房炎及其他乳房疾病乳汁的影響[5-6]，另據(jù)多位學(xué)者證實(shí)，PCR技術(shù)作為檢測牛乳中的布魯菌有很好的效果[7]，故本試驗(yàn)選擇了PCR方法對(duì)牛乳樣本進(jìn)行檢測。

3.2 采用套式PCR方法檢測的234份接種過S2株布魯菌活疫苗的牛乳樣本，18份顯示布魯菌陽性，陽性率達(dá)到7.69%（18/234）。對(duì)檢出的核酸陽性乳樣本進(jìn)行布魯菌種的鑒別，9份牛乳檢測出豬種布魯菌核酸，這可能與該奶牛場接種了S2株布魯菌活疫苗有關(guān)；1份牛乳同時(shí)檢出牛流產(chǎn)布魯菌和豬布魯菌核酸，說明該奶牛感染了牛流產(chǎn)布魯菌野菌株；其余9份牛乳樣本PCR檢測顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，可能與布魯菌屬細(xì)菌主要分為6個(gè)種、19個(gè)生物型（牛流產(chǎn)布魯菌1、2、3、4、5、6、7型和9型；豬布魯菌1、2、3、4型和5型；羊馬爾他熱布魯菌1、2型和3型等）有關(guān)[8]。而目前采用的PCR引物并不能擴(kuò)增出所有生物型的布魯菌，如：AMOSPCR所設(shè)計(jì)的引物只能擴(kuò)增出1、2、4型牛流產(chǎn)布魯菌和1型豬布魯菌[9]。本次試驗(yàn)也采用了AMOSPCR方法對(duì)9份豬布魯菌核酸進(jìn)行鑒定，均出現(xiàn)了陽性擴(kuò)增帶。

3.3 試驗(yàn)采用布魯菌選擇性培養(yǎng)基對(duì)18份陽性牛乳樣本進(jìn)行了病原菌分離，結(jié)果為分離出布魯菌病原菌。出現(xiàn)這一結(jié)果主要有兩種可能性：一方面可能是牛乳中為死亡的布魯菌；另一方面可能是牛乳中其他雜菌較多，大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌，甚至變形桿菌、綠膿桿菌等生長速度太快，完全掩蓋了布魯菌菌落的生長，布魯菌需要在10%二氧化碳、37℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d才能出現(xiàn)肉眼可見的菌落。同時(shí)分離的樣本量較少也是其中一個(gè)因素。

3.4 牛流產(chǎn)布魯菌種的鑒定中6號(hào)牛乳樣本擴(kuò)增出一條285 bp的DNA條帶，與A19株牛流產(chǎn)布魯菌陽性對(duì)照相一致；同時(shí)在圖譜上方還顯現(xiàn)一條423 bp的DNA條帶。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)查詢美國生物信息中心（NCBI）收集的布魯菌OMP2基因核苷酸序列，A1/A2引物除能夠擴(kuò)增牛流產(chǎn)布魯菌形成285 bp的DNA條帶外，對(duì)某些生物型的豬布魯菌也具有相應(yīng)的核苷酸序列，預(yù)期擴(kuò)增長度為423 bp。根據(jù)A1/A2引物的PCR擴(kuò)增圖譜和S1/S2的核酸檢測結(jié)果，6號(hào)牛乳系牛流產(chǎn)布魯菌與豬布魯菌核酸的混合污染樣本。

[1]李鵬，羅德炎，高永輝，等.布氏桿菌BCSP31/pVAX1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)效果的研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（6）：493-497.

[2]殷文武，孫輝.中國布魯菌病疫情形勢及對(duì)策建議[J].疾病監(jiān)測，2009，7：475-477.

[3]王麗，馬國柱.PCR技術(shù)用于布魯氏菌病的診斷研究[J].中國地方病防治雜志，2004，19（2）：65-67.

[4] 李艷，苗利光，劉艷環(huán).檢測和鑒別流產(chǎn)布魯氏菌與豬布魯氏菌的復(fù)合PCR方法的建立[J].特產(chǎn)研究，2008，3：1-3.

[5]臧鵬偉，張振嵐，范萬東，等.全乳環(huán)狀試驗(yàn)檢測奶牛布氏桿菌病的試驗(yàn)探討[J].中國獸醫(yī)雜志，2005，41（12）：50-51.

[6]樊兵菊，宋喜山，梁琴.全乳環(huán)狀試驗(yàn)在奶牛布病檢測中的應(yīng)用[J].奶牛雜志，2006，2：31.

[7]Cortez A，Scarcelli E，Soares R M，et al.Detection of Brucella DNA from aborted bovine foetuses by polymerase chain reaction[J].AustVet J，2001，79：500-501.

[8]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.哺乳動(dòng)物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局譯.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)出版社，2002：308-310.

[9]鐘旗，范偉興，何倩倪，等.用AMOS-PCR對(duì)布魯氏桿菌種型鑒定的研究[C].北京：全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部、中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，2006：262-265.