G-CSF 對腦出血大鼠血腫周圍血管新生的作用機制研究

何曉英，付 華，劉永剛，李小剛

隨著我國老齡化進程加劇，腦出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)發(fā)病率正呈現(xiàn)弓背式抬高，然而ICH 病理機制復(fù)雜，基礎(chǔ)性研究較腦梗死薄弱，目前除采取內(nèi)科脫水降低顱內(nèi)壓減輕腦水腫、外科手術(shù)清除血腫等外，尚缺乏有效干預(yù)措施改善臨床終點事件。近年來，應(yīng)用三維成像技術(shù)在缺血性腦血管病的研究中發(fā)現(xiàn)大鼠患側(cè)新生腦血管計數(shù)大于健側(cè)，且患側(cè)腦組織微血管的密度增高與預(yù)后成正相關(guān)［1］，在實驗性ICH 模型中也發(fā)現(xiàn)血腫周圍同樣存在新生血管生成，且血腫周圍血管新生、微循環(huán)系統(tǒng)的重建在腦組織修復(fù)、神經(jīng)元抗損傷的過程中扮演著重要角色［2］。粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是體內(nèi)一種多肽鏈細胞生長因子，能刺激造血祖細胞增殖、分化，在臨床廣泛用于化療引起的中性粒細胞減少等。越來越多的研究表明，G-CSF 作為一種新型神經(jīng)保護因子，可透過血腦屏障，通過抑制細胞調(diào)亡、動員骨髓干細胞、減輕炎癥反應(yīng)等機制，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的非造血功能［3，4］。因此，本研以ICH 后微血管新生為切入點，探討G-CSF 對ICH 新生血管的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗試劑及儀器 重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF，深圳新鵬公司);CD34 抗體、VEGF 抗體、二抗、SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、PBS 緩沖液(武漢博士德公司)。WDT-V型鼠腦立體定向儀(西安西北光電儀器廠);50 μl 微量進樣器(上海激光醫(yī)學(xué)儀器廠)。

1.1.2 實驗動物及處理 63 只體重為250～320g 的健康SD 大鼠由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，隨機分成假手術(shù)組(n=21)、ICH 組(n=21)、治療組(n=21)，每組又分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d、21 d 7 個亞組(n=3)。治療組于造模1 h 后腹腔注射rhG-CSF 60 μg/kg，假手術(shù)組、ICH 組僅經(jīng)腹腔注入相同容積的等滲鹽水。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ICH 模型制作 SD 大鼠術(shù)前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射后，將其俯臥位固定在立體定位儀上，無菌操作暴露前囟，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，定位于前囟前0.2 mm、中線右側(cè)旁開3 mm、深6 mm 為注血點，將非肝素抗凝斷尾獲取的動脈血50 μl，先注入10 μl，停針2 min，后緩慢注入40 μl，整個注血時間約5 min，注血完畢后留針15 min，再緩慢退針。術(shù)后青霉素粉末涂抹局部，縫合皮膚。所用手術(shù)器械均經(jīng)高壓滅菌消毒，整個手術(shù)過程無菌操作。假手術(shù)組:參照上述方法，經(jīng)注入點注入等量無菌生理鹽水。

1.2.2 ICH 大鼠各時間點神經(jīng)功能障礙評分

各組大鼠分別于術(shù)后6 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d、21 d 處死前按Garcia 的方法進行神經(jīng)功能評分，最高分18 分，最低分3 分，分數(shù)越低，神經(jīng)功能障礙越重。

1.2.3 CD34、VEGF 免疫組化檢測 實驗動物于術(shù)后6 h、24 h、48 h、72 h、7 d、14 d、21 d 麻醉，經(jīng)主動脈灌注4%多聚甲醛內(nèi)固定后斷頭取腦，外固定石蠟包埋，自動切片機按片厚5 μm 進行連續(xù)切片。按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明進行染色。

各組于相應(yīng)時間點每只大鼠每個指標(biāo)選取一張腦切片，在400 倍光鏡下進行觀察。(1)CD34 主要定位于較早的血管內(nèi)皮細胞，代表新生血管，任何染成棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮或內(nèi)皮細胞簇均為1 個血管計數(shù)，每張切片計數(shù)5 個不同視野下CD34+血管數(shù);(2)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為VEGF 陽性細胞，每張切片計數(shù)5 個不同視野下陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能障礙評分

ICH 后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，各時間點神經(jīng)功能障礙評分均低于假手術(shù)組(P＜0.05)，48 h～72 h 癥狀達高峰。治療組6 h 神經(jīng)功能障礙評分與ICH 組比較無顯著差異，6 h 后各時間點神經(jīng)功能障礙評分明顯高于ICH 組(P＜0.05)(見表1)。

2.2 G-CSF 對ICH 大鼠CD34+血管數(shù)的影響

CD34 陽性反應(yīng)主要在幼稚的新生血管內(nèi)皮細胞表達，內(nèi)皮細胞胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。假手術(shù)組僅見少許CD34+血管表達;ICH 組CD34+血管數(shù)從6 h 開始增多，14 d 達高峰，各時間點均較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.05);治療組CD34+血管數(shù)高峰提前至7 d，14 d 時仍維持在較高水平，各時點較ICH 組明顯增多(P＜0.05)(見表2)。

2.3 G-CSF 對ICH 大鼠VEGF 表達的影響

VEGF 蛋白主要分布于神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞的胞漿中，胞漿成棕黃色為VEGF 陽性細胞。假手術(shù)組僅見少量VEGF 陽性細胞表達;ICH 組VEGF 陽性細胞數(shù)從6 h 開始增多，7～14 d 達高峰，21 d 明顯減少，各時間點與假手術(shù)組比較明顯增多，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);治療組各時間點VEGF陽性細胞數(shù)較ICH 組明顯增多(P＜0.05)，高峰提前至72 h～7 d，14 d 仍持續(xù)較高水平表達(見表3)。

表1 各組不同時間點神經(jīng)功能障礙評分(±s)

表1 各組不同時間點神經(jīng)功能障礙評分(±s)

與假手術(shù)組比較△P＜0.05;與ICH 組內(nèi)其他時間點比較#P＜0.05;與ICH 組比較▽P＜0.05

表2 術(shù)后各組不同時間點CD34+血管數(shù)比較(±s 個數(shù)/視野)

表2 術(shù)后各組不同時間點CD34+血管數(shù)比較(±s 個數(shù)/視野)

與假手術(shù)組比較△P＜0.05;與ICH 組內(nèi)其他時間點比較#P＜0.05;與ICH 組比較▽P＜0.05;與治療組內(nèi)其他時間點比較* P＜0.05

表3 各組不同時間點VEGF 陽性細胞計數(shù)(±s，個數(shù)/視野)

表3 各組不同時間點VEGF 陽性細胞計數(shù)(±s，個數(shù)/視野)

與假手術(shù)組比較△P＜0.05;與ICH 組內(nèi)其他時間點比較#P＜0.05;與ICH 組比較▽P＜0.05;與治療組內(nèi)其他時間點比較* P＜0.05

3 討論

G-CSF 屬造血生長因子家族的一員，已在臨床長期廣泛應(yīng)用，對人體安全性已無需置疑，其生物學(xué)特性除影響粒細胞系統(tǒng)外，還可發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護作用。Laske 等實驗中發(fā)現(xiàn)早期阿爾茨海默病患者血漿中G-CSF 明顯降低，提出了外源性GCSF 有望成為治療阿爾茨海默病的新策略［5］。Pitzer等觀察到脊髓損傷后G-CSF 可以抑制其細胞凋亡和促進神經(jīng)再生［6］。Sevimli 等從基因水平證實G-CSF治療的腦梗死大鼠，梗死灶顯著縮小，神經(jīng)功能恢復(fù)良好［7］。本實驗前期研究也證實G-CSF 通過抑制MMP-9 表達減輕ICH 大鼠血腫周圍水腫程度、抑制星型膠質(zhì)細胞過度活化發(fā)揮神經(jīng)保護作用［8］。最近Sugiyama 等還在實驗中觀察到G-CSF 通過促進腦梗死后血管新生、改善腦血流灌注、從而減輕腦損傷［9］，而G-CSF 對ICH 后血管新生的影響尚未見報道。

ICH 后血腫水腫對血管床壓迫、血管活性物質(zhì)引起血管痙攣、凝血衍生因子釋放、血腦屏障破壞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞凋亡等，諸多因素的主要損傷靶點除神經(jīng)元外，也包括微血管系統(tǒng)，造成腦血流障礙，最終導(dǎo)致血流高度依賴的腦組織受損表現(xiàn)出一系列神經(jīng)功能缺損癥狀［10］。因此，ICH 后促進微血管新生、改善腦血流狀況具有重要意義。實驗已證實大鼠ICH 后7 d 在血腫周圍可見壁薄、擴張的新生血管，14 d 新生血管開始伸入血腫內(nèi)，并且血管新生的時程特點與ICH 大鼠的運動功能恢復(fù)過程一致，提示ICH 后機體發(fā)揮自我修復(fù)功能，神經(jīng)功能恢復(fù)可能部分是血管新生的結(jié)果［11］。Xi 等進一步驗證了血管新生的程度與ICH 的存活及阻止損傷引起的神經(jīng)變性呈正相關(guān)，血管密度可作為判定ICH 預(yù)后和預(yù)測神經(jīng)功能恢復(fù)的指標(biāo)［12］。

血管新生是微循環(huán)重建的主要途徑，指在各種病損誘導(dǎo)下，在已存在的血管基礎(chǔ)上內(nèi)皮細胞通過出芽、修剪、內(nèi)填、套迭等方式重建新的血管網(wǎng)絡(luò)［13］。新生的微血管主要由內(nèi)皮細胞構(gòu)成，所以可以利用內(nèi)皮細胞標(biāo)志性抗原的變化來了解微血管的生成情況，標(biāo)志性抗原越多，新生血管也越多。CD34抗原是一種高度糖基化的I 型跨膜糖蛋白，在生理情況下CD34 抗原可在血管內(nèi)皮細胞中表達，黏附、加速血管前內(nèi)皮細胞聚集，在一定的條件下分化成內(nèi)皮細胞參與血管生成;在病理損害或體外細胞因子的刺激下，CD34 抗原被動員出骨髓，并定向遷移到損傷部位參與并增強局部血管重建。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CD34 細胞是毛細血管內(nèi)皮細胞的祖細胞，在兩相鄰的內(nèi)皮細胞未完全發(fā)育形成緊密連接時表達CD34，即在內(nèi)皮細胞的增生、運動和遷移階段表達CD34，而成熟后則為CD34 陰性血管［14］。因此，CD34 抗原在新生血管內(nèi)皮中表達遠遠大于非新生血管內(nèi)皮，是最敏感的新生血管內(nèi)皮標(biāo)記物，CD34陽性表達是檢測早期新生血管的良好方法。本實驗檢測了ICH 后的血管新生情況，結(jié)果顯示ICH 組血腫周圍CD34+血管數(shù)從6 h 開始增多，并逐漸增加，到14 d 達高峰，各時間點均高于假手術(shù)組，提示ICH后在一系列病理改變介導(dǎo)下機體發(fā)揮自我修復(fù)功能，新生血管明顯增多，為出血后神經(jīng)發(fā)生、突觸重建和損傷神經(jīng)元修復(fù)創(chuàng)造良好的微環(huán)境，為損傷區(qū)域神經(jīng)功能康復(fù)奠定基礎(chǔ)［15］。而經(jīng)G-CSF 干預(yù)后，治療組各時間點CD34+血管數(shù)表達較ICH 組明顯增多，高峰提前至7 d，14 d 時仍維持在較高水平，提示G-CSF 作用下ICH 中CD34 新生血管陽性表達高峰提前，高水平表達時間延長，說明G-CSF 能夠明顯增加ICH 后血腫周圍新生血管數(shù)量，從而改善腦血流狀況，充足的腦血流一方面有助于神經(jīng)元獲取能量、利于神經(jīng)再生，另一方面也有助于藥物到達病灶充分發(fā)揮藥物效能，促進功能恢復(fù)。

血管新生過程的調(diào)控和信號傳導(dǎo)復(fù)雜而嚴格，除單核細胞、細胞粘附分子-1 外，血管生長因子、細胞外基質(zhì)大分子、細胞活素類等多種刺激和抑制因子也參與了調(diào)控，其中血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是迄今為止唯一被證明對血管形成起關(guān)鍵作用且具有特異性的生長調(diào)節(jié)因子［16］，對血管新生的突出作用是作為內(nèi)皮細胞促有絲分裂原促進內(nèi)皮細胞增殖、加速新生血管形成。正常機體內(nèi)VEGF 呈持續(xù)低水平表達，以維持原有血管密度及維持血管對運輸營養(yǎng)物質(zhì)所需通透性的作用，而在缺血缺氧、外傷、炎癥、腫瘤等腦損傷的病理過程中VEGF 表達明顯上調(diào)，通過VEGFR-1 和VEGFR-2 兩個受體結(jié)合促進血管新生，從而重建損傷組織的代謝和營養(yǎng)系統(tǒng)［17］。動物實驗證明腦梗死2 h 后VEGFmRNA 即明顯表達，14 d 達高峰，28 d 后仍維持在較高水平，VEGF 表達極度上調(diào)后，微血管密度增加明顯，從而可有效改善缺血半暗帶的血供［18］。Lei 等在膠原酶誘導(dǎo)的ICH 模型中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后血腫周圍VEGF 即開始上升，并且持續(xù)到7～14 d，促進神經(jīng)功能恢復(fù)［19］。VEGF 表達明顯上調(diào)有利于新生血管的生成，在早期促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，在后期能促進新生血管的成熟與穩(wěn)定，同時可以改善組織缺血缺氧、減輕腦水腫及促進神經(jīng)干細胞增殖而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［20］。本研究觀察到ICH 后血腫周圍VEGF 從6 h 開始逐漸增多，7 d～14 d 達高峰，21 d 時表達減少，與Lei 等的報道基本一致，提示ICH 后發(fā)生的一系列病理改變誘導(dǎo)機體啟動自我保護和恢復(fù)機制，上調(diào)VEGF 表達，可促進微血管新生、有利于改善微循環(huán)狀態(tài)。經(jīng)G-CSF 干預(yù)后，各時間點血腫周圍VEGF 表達明顯高于ICH 組，且VEGF 高峰提前出現(xiàn)并維持在較高水平，與CD34 微血管陽性表達趨勢基本一致，提示G-CSF 可上調(diào)ICH 后VEGF 的表達，誘導(dǎo)ICH 損傷區(qū)新生血管形成。從實驗中我們也觀察到經(jīng)G-CSF治療后，與未進行干預(yù)的ICH 大鼠比較其神經(jīng)功能恢復(fù)狀況明顯好轉(zhuǎn)。

ICH 后G-CSF 干預(yù)可促進新生血管生成，利于神經(jīng)功能恢復(fù)，作用機制推測是上調(diào)了VEGF 表達，但確切調(diào)控及信號傳導(dǎo)機制有待進一步研究。

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