菜薹與蘿卜附加系回交后代外源蘿卜染色體的FISH檢測

（北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹與蘿卜附加系回交后代外源蘿卜染色體的FISH檢測

趙 泓 馬運其 丁云花*

（北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097）

采用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），以蘿卜基因組特異序列pURsN作探針，分別與19份菜薹與蘿卜附加系回交后代BC4A3d進行雜交，檢測回交后代中外源蘿卜染色體的存在情況。結果顯示：只有1份材料BC4A3d-45沒有雜交信號，其他18份材料均得到1個雜交信號，表明除了BC4A3d-45沒有附加外源蘿卜染色體之外，其余18份材料均含有1條外源蘿卜染色體；該結果與分子標記鑒定結果一致。

熒光原位雜交技術；蘿卜附加系；染色體

熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是20世紀80年代末在已有的放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，具有直觀、靈敏度高、信號強、能同時顯示多種不同顏色等優(yōu)點，已被廣泛應用于遺傳學、分子生物學等領域，（Ragburn & Gill，1985；Laptian et al.，1989；Fukui et al.，1994；Jiang & Gill，1994；奇文清和李愁學，1996；楊國華 等，2002），成為外源染色體（質）、外源染色體片段或基因鑒定的重要工具。在蕓薹屬作物上，F(xiàn)ISH技術已被用于鑒別3個二倍體基本種和3個復合種一些染色體的標記（Hasterok & Maluszynska，2000a，2000b，2000c；Hasterok et al.，2001）。

本試驗在分子標記鑒定的基礎上，采用蘿卜基因組探針pURsN檢測19份菜薹與蘿卜染色體附加系回交后代BC4A3d中的外源蘿卜d染色體的存在情況，并驗證這19份材料的分子標記鑒定結果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年3～6月在北京市農林科學院蔬菜研究中心進行。在對菜薹與蘿卜d染色體附加系回交后代BC4A3d進行分子標記鑒定的基礎上，選取19株形態(tài)學性狀與回交親本菜薹非常接近的單株進行熒光原位雜交檢測，其中18株含有蘿卜d染色體特異分子標記，1株不含蘿卜d染色體特異分子標記（圖1）。每份材料取3～4個花序，將長度為1～3 mm的花蕾取下后立刻浸泡在新鮮的卡諾固定液中，4 ℃固定24 h后轉入75%酒精保存。

圖1 菜薹與蘿卜附加系回交后代BC4A3d PCR檢測結果

1～19分別代表BC4A3d-7、BC4A3d-9、BC4A3d-10、BC4A3d-12、BC4A3d-11、BC4A3d-16、BC4A3d-21、BC4A3d-23、BC4A3d-24、BC4A3d-36、BC4A3d-39、BC4A3d-41、BC4A3d-42、BC4A3d-48、BC4A3d-45、BC4A3d-59、BC4A3d-63、BC4A3d-65，下圖同。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘿卜探針制備 蘿卜基因組特異探針pURsN的制備方法參見Hirai等（1995）的方法。

1.2.2 材料酶解 取固定后的花蕾于蒸餾水中浸泡10 min，用解剖針剝取花藥，在檸檬酸緩沖液中浸泡5～10 min。用移液槍吸凈緩沖液，每個花藥加100 μL含有2%纖維素酶和0.5%果膠酶的混合酶液，放入37 ℃分子雜交爐中酶解3 h，再將花藥轉入蒸餾水中浸泡10 min。

1.2.3 制片 將酶解后的花藥置于載玻片上，加20 μL新鮮的卡諾固定液，用鑷子將花藥輕輕敲碎，再加20 μL固定液將細胞打散。用酒精燈火焰灼燒固定。載玻片室溫風干、過夜待用。

1.2.4 熒光原位雜交 參考Schrader等（2000）的方法進行熒光原位雜交，采用Nikon Eclipse 80i顯微鏡，在10倍目鏡、20倍物鏡下對雜交結果進行整體觀察和初步判斷；之后選取100倍物鏡下的5～10個視野，采用NIS-Elements軟件分別對2個光通道進行拍攝、疊加，然后進行信號分析和統(tǒng)計。

2 結果與分析

在熒光顯微鏡下進行觀察，染色質為藍色，信號為紅色。在10倍目鏡、20倍物鏡下對雜交情況進行初判，之后在100倍物鏡下隨機選取5～10個視野進行拍攝，并將2個光通道疊加，結果如圖2所示。其中18份材料均得到1個雜交信號，只有1份材料BC4A3d-45沒有信號。該結果與分子標記鑒定結果一致。

圖2 菜薹與蘿卜附加系回交后代BC4A3d FISH檢測結果

3 結論與討論

本試驗選擇花蕾作試材的原因有兩個：一是回交世代是一個分離世代，個體間可能存在差異，有的攜帶蘿卜d染色體，有的則不攜帶。如果用種子萌發(fā)后的根尖作試材，有可能會丟失寶貴材料。二是每株回交后代具有眾多的花蕾，試驗材料數(shù)量不受限制。用花蕾作試材不僅可以知道回交后代含有蘿卜染色體的數(shù)目，而且還可以觀察減數(shù)分裂過程中蘿卜染色體在整個細胞周期中的行為，為遺傳育種試驗方案設計提供參考。

在熒光顯微鏡觀察過程中，發(fā)現(xiàn)個別材料大部分細胞具有1個信號，少部分細胞偶爾出現(xiàn)2個信號，或者沒有信號；有的細胞會出現(xiàn)多個弱信號，或者1個強信號與多個弱信號混雜在一起。信號數(shù)目多可能是由于探針純度不夠或背景不干凈造成的假信號；或者是2個細胞部分重疊，而信號都在沒有發(fā)生重疊的部位。沒有信號或信號很弱可能是由于細胞質較厚，或者雜交過程有瑕疵造成的?；跓晒庠浑s交技術本身的特點，在兼顧試驗結果準確可靠和盡可能提高工作效率的前提下，隨機選取5～10個視野對細胞及其信號數(shù)目作統(tǒng)計。如果85%以上的細胞具有相同的信號數(shù)目，就認為這份材料具有信號數(shù)目的蘿卜染色體數(shù)；否則需要對這份材料重新進行熒光原位雜交。小孢子母細胞是以單細胞形式分散固定在載玻片上，它的體積顯著大于體細胞，10倍目鏡、100倍物鏡下一個視野中只能顯示1個或1個半細胞。體細胞體積小，一個視野中會有許多細胞，細胞之間難免會相互重疊。為了保證細胞類型統(tǒng)一，同時信號分明，因此選擇處于減數(shù)分裂間期的小孢子母細胞進行觀察。

本試驗選取的19份材料是在分子標記鑒定基礎上篩選出來的，PCR擴增結果只有BC4A3d-45沒有出現(xiàn)蘿卜染色體的特異條帶，而FISH鑒定結果也顯示BC4A3d-45沒有雜交信號，說明熒光原位雜交鑒定結果與分子標記鑒定結果一致。本試驗采用熒光原位雜交技術不僅可以檢測外源染色體的有無，還可以根據(jù)雜交信號的多少鑒定外源染色體的數(shù)目，這是分子標記技術不可替代的。本試驗中18份材料都只有1個雜交信號，說明附加的蘿卜d染色體是以單倍的形式存在。這種形式遺傳不穩(wěn)定，在每次回交過程中都會出現(xiàn)分離。因此，本試驗材料需進一步進行自交，使附加的外源蘿卜d染色體在后代中以二倍形式存在，才能得到可穩(wěn)定遺傳的附加蘿卜d染色體的菜薹材料。

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楊國華，英加，李濱，劉建中，李振聲．2002．熒光原位雜交技術在植物細胞遺傳學和繪制基因圖譜中的應用現(xiàn)狀與展望．西北植物學報，22（2）：421-429．

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Identification of Alien Radish Chromosome in Backcross Progeny of Tai-tsai and Radish Addition Line by FISH Technology

ZHAO Hong，MA Yun-qi，DING Yun-hua*

（Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

Nineteen plants from the backcross progeny BC4A3d derived from backcrossing radish additional line with tai-tsai were analyzed by using fluorescence in situ hybridization（FISH）technology with radish genomic probe pURsN to detect the exogenous radish chromosome in the backcross individuals，so as to confirm the added radish chromosome in the backcross progenies．The results showed that except BC4A3d-45 had no additional exogenous radish chromosome，other 18 plants of the backcross progeny were added an alien radish chromosome．This result is consistent with that of the previous molecular marker identification．

Fluorescent in situ hybridization；Radish addition line；Chromosome

趙泓，女，副研究員，專業(yè)方向：植物生物技術，E-mail：zhaohong@ nercv.org

*通訊作者（Corresponding author）：丁云花，女，副研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：dingyunhua@nercv.org

2014-01-08；接受日期：2014-03-12

國家自然科學基金項目（31071793）