誘導(dǎo)多能性干細胞在心臟疾病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用

王帥飛，王 軍，郎希龍，張 浩

·綜 述·

誘導(dǎo)多能性干細胞在心臟疾病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用

王帥飛，王 軍，郎希龍，張 浩

誘導(dǎo)多能性干細胞；細胞分化；細胞移植；疾病模型；藥物篩選；生物起搏器

誘導(dǎo)多能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是一種類似于胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的、具有自主增殖和分化能力的多能性干細胞。iPSCs可以由各種不同動物的不同體細胞重編程轉(zhuǎn)化而來，能增殖并分化成各種體細胞，其中包括具有收縮和興奮功能的心肌細胞。截止目前，iPSCs分化的心肌細胞主要用于以下幾個方面：通過細胞移植治療缺血性心肌病及心肌梗死；在體外建立遺傳性心臟病模型，研究其發(fā)病機制；檢測藥物心臟毒性，篩選患者特異性個體化藥物；構(gòu)建心臟生物起搏器。

iPSCs具有類似于ESCs的全能性，并能自主增殖和分化，可以由患者的體細胞重編程轉(zhuǎn)化獲取，避免了ESCs應(yīng)用的社會倫理問題和移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，因而為干細胞生物學和臨床再生／修復(fù)醫(yī)學提供了新的方向［1］。本文主要論述iPSCs分化為心肌細胞的相關(guān)研究及其在心臟疾病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

1 iPSCs

1.1 iPSCs的概念 2006年日本科學家Yamana?ka［2］等通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將多能性相關(guān)因子Oct4、Sox2、Klf4和c－Myc轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細胞，產(chǎn)生了形態(tài)、生長特性與ESCs相似的細胞，并能自主增殖、分化為擬胚體（EB），證明其具有多向分化的潛能。這種將體細胞重編程產(chǎn)生的具有多向分化潛能的細胞被稱為iPSCs，這項技術(shù)被稱作iPSC技術(shù)。不久，Yu等［3］將Oct4、Sox2、Nanog和Lin28轉(zhuǎn)入人的體細胞，產(chǎn)生了類似人的ESCs的人hiPSCs。

1.2 iPSCs技術(shù)的發(fā)展 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠?qū)⒍嗄苄韵嚓P(guān)因子導(dǎo)入體細胞使其重編程為iPSCs，但是轉(zhuǎn)化效率極低。近期研究發(fā)現(xiàn)，維生素C［4］、組蛋白去乙酰酶抑制物（如丙戊酸）、TGFβ受體阻滯劑等可以提高iPSCs生成的效率［5－6］。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因可以整合到宿主基因組，重編程因子c－Myc為原癌基因，使得腫瘤形成風險增大［7］。為了減少腫瘤形成風險，目前多采用無c－Myc重編程技術(shù)［8］，應(yīng)用非整合性的腺病毒載體或者直接向靶細胞導(dǎo)入重編程蛋白［9－10］。

2 iPSCs定向分化為心肌細胞的相關(guān)研究

iPSCs可自動分化為EB，出現(xiàn)收縮性心肌細胞［11］。研究證實，分化的心肌細胞（iPSCs－CMs）的分子結(jié)構(gòu)、功能特性與早期心肌細胞類似，且具有分裂增殖能力［12］。電生理研究證實，iPSCs－CMs表現(xiàn)出心室樣、心房樣、竇房結(jié)樣動作電位［13］，且表達典型的心肌細胞離子通道。iPSCs－CMs對神經(jīng)激素類刺激物極為敏感［14］，加入異丙腎上腺素可以見到動作電位頻率明顯增加，而加入鈉通道阻滯劑利多卡因、L－型鈣通道阻滯劑硝苯地平、鉀通道阻滯劑E4031后動作電位頻率則明顯減低。針對iPSCs分化效率低，科研人員嘗試加入內(nèi)胚層分泌的促心肌生成因子和TGF－β來提高心肌分化效率。研究發(fā)現(xiàn)，活化素A、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4／2、堿性成纖維細胞生長因子、Wnt抑制劑等加入培養(yǎng)基能有效提高分化效率［15］。

3 iPSCs在心臟病領(lǐng)域的應(yīng)用

以上研究使得iPSCs為心臟再生／修復(fù)醫(yī)學和心臟疾病的研究提供了新的方向，這些應(yīng)用研究包括：通過細胞移植治療缺血性心肌病及心肌梗死；在體外建立遺傳性心臟病模型，研究發(fā)病機制；檢測藥物心臟毒性，篩選患者特異性個體化藥物以及心臟生物起搏器的構(gòu)建等（圖1）。

圖1 iPSC細胞在心臟病領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 缺血性心肌病的治療 2009年，Nelson［16］等將鼠源未分化的iPSCs和成纖維細胞分別移植入急性心肌梗死的小鼠心肌內(nèi)，術(shù)后行心臟彩超檢查顯示，iPSCs組在第一周后心臟射血分數(shù)明顯較對照組好，這種趨勢一直維持到第4周；iPSCs組室壁基本正常，而對照組在第4周左室前壁變薄、心尖部有室壁瘤形成；iPSCs組左室舒張末內(nèi)徑（LVDd）和QT離散度明顯較對照組減?。唤M織活檢也顯示iPSCs組心臟體積總體較對照組小。另外，研究中雖然發(fā)現(xiàn)將未分化的iPSCs注入免疫缺陷心肌梗死鼠后，可以在梗死心肌和周圍逐漸形成腫瘤，但是在免疫功能正常的鼠中觀察8周未見腫瘤形成，這提示免疫功能正常情況下可以提供一個iPSCs定向向心肌分化的微環(huán)境。2011年，Mauritz［17］等報道，iPSCs來源的Flk－1＋細胞無論在體內(nèi)還是在體外，均可以分化為心肌細胞，將iPSCs－Flk1＋細胞移植入急性心肌梗死的小鼠體內(nèi)，可以明顯改善心臟功能和心臟重構(gòu)。

2013年，Zhang［18］等報道，將豬未分化iPSCs移植到豬心梗區(qū)域，與對照組相比，血管再生明顯增多，血管內(nèi)皮生長因子及CX43增多，而神經(jīng)生長因子減少，交感神經(jīng)重塑減少，氧化應(yīng)激明顯改善，炎癥反應(yīng)明顯減輕，通過電刺激誘導(dǎo)室性心律失常也明顯減少，從而證實了iPSCs細胞移植能預(yù)防心梗后室性心律失常發(fā)生。2013年，Yan［19］等將iPSCs和iPSCs－CMs共同植入糖尿病鼠心肌，發(fā)現(xiàn)可減輕氧化應(yīng)激損傷（促氧化表達減少，抗氧化劑如過氧化氫酶和MnSOD表達上升）及相關(guān)的細胞凋亡和纖維化（Akt上調(diào)，ERK1／2下調(diào)），減緩不良心肌重塑，超聲心動圖提示心臟功能提升。2013年，Yama?da［20］報道，將iPSCs植入鼠心梗區(qū)域，可以提高左室傳導(dǎo)性及收縮性能，減少瘢痕形成，逆轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)重塑，減緩心肌失代償，有望使缺血心肌異常室壁運動重新同步化。但是iPSCs能否用于臨床治療心肌梗死的患者，還需要更多的動物實驗尤其大動物實驗來進行證實，以進一步證明iPSCs用于細胞移植的有效性和安全性。

3.2 遺傳性心臟病模型的建立及發(fā)病機制研究iPSCs技術(shù)可以取遺傳性心臟病患者自身的體細胞重編程為iPSCs，誘導(dǎo)定向分化為iPSCs－CMs，在體外建立遺傳性心臟病患者的疾病細胞模型，從細胞水平研究其發(fā)病機制，篩選特異性藥物，嘗試通過基因修飾探索基因治療方案。Moretti［21］等取1型長QT綜合征（LQTS）患者皮膚成纖維細胞重編程并誘導(dǎo)分化為iPSCs－CMs，發(fā)現(xiàn)細胞仍然保留有1型LQTS的基因型（常染色體錯義突變R19OQ），與正常對照組相比，細胞動作電位時程明顯延長，對兒茶酚胺導(dǎo)致的心動過速易感性增加，而用β腎上腺素受體阻滯劑則可以減輕這種變化。2011年，Itzha?ki［22］等取2型LQTS（KCNH2基因上A614V點突變導(dǎo)致）患者的體細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，發(fā)現(xiàn)其動作電位時程明顯延長，而這種延長主要是由于心臟快速延遲整流鉀電流（Ikr）顯著減少導(dǎo)致，而且這種細胞顯示出明顯的致心律失常性，主要表現(xiàn)為早期后除極和誘發(fā)性的心律失常，這與患者的臨床特征相吻合。2013年，Belin［23］等獲取2型LQTS患者的體細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，通過對突變位點準確的基因糾正，使 Ikr電流和動作電位時程恢復(fù)正常。2013年，Ma［24］等取3型LQTS（SCN5A突變）患者的體細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs建立疾病模型，與正常組對照發(fā)現(xiàn)，其動作電位明顯延長，TTX敏感鈉通道增加，動作電位平臺期鈉通道難失活且易復(fù)活，利用鈉通道阻滯劑美西律可逆轉(zhuǎn)此病理過程。

2013年，Caspi［25］等獲取致心律失常右室心肌?。ˋRVC）患者的體細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs，建立疾病模型研究ARVC發(fā)病機制（PKP2突變），實時（聚合酶鏈反應(yīng)，PCR）發(fā)現(xiàn)PKP2表達顯著下降，免疫染色發(fā)現(xiàn)橋粒蛋白及CX43表達下降，電生理發(fā)現(xiàn)場電位上升時間延長，電子顯微鏡觀察到增寬和扭曲的橋粒及胞內(nèi)脂滴聚集，這與促脂生成轉(zhuǎn)錄因子PPAR－γ上調(diào)有關(guān)，發(fā)現(xiàn)了應(yīng)用糖原合成激酶GSK－3β阻滯劑可以抑制此病理過程。2013年，Zhang［26］等取兒茶酚胺依賴多形性室速（CPVT，蘭尼堿受體RyR2點突變導(dǎo)致）患者的體細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs－CMs建立疾病模型，與正常組對照發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與鈣信號通路改變有關(guān)：鈣信號通路單一，胞內(nèi)鈣儲備較低，（鈣誘導(dǎo)鈣釋放，CICR）獲得較高，對腎上腺素能調(diào)節(jié)敏感。iPSCs技術(shù)在體外建立遺傳性心臟病患者的疾病細胞模型，為疾病發(fā)病機制研究、藥物測試及篩選、新的治療方法的探索提供了一個更為方便、有效的平臺。

3.3 藥物心臟毒性檢測及藥物篩選 心血管疾病藥物往往具有副作用，主要表現(xiàn)為心臟毒性和致心律失常作用，而且心臟病患者對藥物的副作用更為敏感，因而可以用iPSCs－CMs在體外建立藥物檢測模型，較當前應(yīng)用永生細胞系和動物模型測試藥物的敏感性和特異性更高。Ma［27］等利用3型LQTS患者的iPSCs－CMs在體外構(gòu)建了三維絲狀心肌組織用來研究其收縮異常機制，并檢測一系列藥物的心臟毒性。Navarrete［28］等利用hiPSCs－CMs和低阻抗微電極陣列檢測了hERG鉀通道阻滯劑（如索他洛爾、奎尼?。┑闹滦穆适СＷ饔茫ê蟪龢O化提前和異位搏動），較當前的永生細胞系／動物模型更敏感有效，能準確鑒別假陽性和假陰性hERG阻滯劑。Guo［29］等利用88種藥物和30種內(nèi)源性分子對hiP?SCs－CMs節(jié)律性和搏動頻率的影響，建立了人心肌細胞失節(jié)律風險（hCAR）模型，更有效地評價藥物的致心律失常作用以及尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常、LQTS的發(fā)生風險。此外，心血管疾病藥物尤其是抗心律失常藥物往往存在異質(zhì)性，個體差異較大，對于心律失常患者而言，同一種藥物，并不能取得相同療效，而源自患者的iPSCs－CMs具有其特異性，可以針對個體進行藥物篩選。但是目前尚不能肯定人的iP?SCs－CMs與患者體內(nèi)心肌細胞對藥物的反應(yīng)是否一致。

3.4 生物心臟起搏器的構(gòu)建 電生理檢測發(fā)現(xiàn)iP?SCs－CMs表現(xiàn)室性、房性、結(jié)性動作電位，說明其中含有竇房結(jié)樣起搏細胞，具有構(gòu)建生物起搏器的潛能。2012年，Mandel［30］等對人毛囊細胞源iPSCs－CMs連續(xù)15天行細胞外電描記，進行非線性動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，iPSCs－CMs的搏動與竇房結(jié)細胞相似，具有搏動頻率變異性（BRV），搏動頻率－時間關(guān)系呈冪次分布（Power－Law Behavior），對腎上腺素能／膽堿能刺激物反應(yīng)敏感，證實了hiPSCs－CMs具有生物起搏潛能，但是搏動平均頻率過慢（39～70 bpm）。Kuzmenkin［31］等發(fā)現(xiàn)，盡管iPSCs向心血管系統(tǒng)定向分化時可以分化為心房肌、心室肌、血管以及傳導(dǎo)系統(tǒng)的細胞，但是大部分分化而來的細胞（80%～90%）還是表現(xiàn)為心室肌細胞樣的動作電位。因此，誘導(dǎo)iPSCs盡可能向結(jié)樣細胞分化以獲得較高純度的起搏細胞成為生物起搏亟需解決的問題。Jiang［32］等發(fā)現(xiàn)iPSCs中鈣激活鉀通道（SKCa）表達較低，Kleger［33］等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SKCa激活劑可以促進此通道活化，激活Ras－Mek－Erk信號通路，有助于iPSCs向起搏細胞分化。Zhu［34］等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β／表皮生長因子受體（NRG－1β／ErbB）信號通路調(diào)節(jié)hESCs－CMs中結(jié)樣心肌細胞與工作樣心肌細胞的比例，通過抑制該信號通路有利于hESCs向起搏細胞分化。當然，利用起搏細胞特異性表面標記從分化心肌細胞中進一步篩選起搏細胞也是一種方法。然而iPSCs來源的起搏細胞其起搏頻率尚無法達到臨床應(yīng)用的水平，通過對其進行進一步的基因修飾（如導(dǎo)入起搏基因或者縫隙連接蛋白Cx45）有望提高其起搏效率。

4 前 景

短短幾年，iPSCs技術(shù)取得了巨大發(fā)展，其在心臟疾病研究、治療方面也取得了明顯進步。目前存在的主要問題是iPSCs的重編程機制尚未完全闡明、重編程及誘導(dǎo)分化技術(shù)尚缺少統(tǒng)一的標準及其遠期的安全性問題［35］。盡管如此，iPSCs技術(shù)為再生／修復(fù)醫(yī)學提供了一條有效可行的道路，必將促進再生／修復(fù)醫(yī)學的快速發(fā)展。在心臟疾病領(lǐng)域，盡管iPSCs－CMs的應(yīng)用研究尚處在起步階段，但現(xiàn)有研究已經(jīng)表明這一技術(shù)在心臟疾病的治療中具有非常光明的應(yīng)用前景，為未來心臟疾病的治療開啟了全新的研究方向。

［1］ Vogel G.Breakthrough of the year.Reprogramming Cells［J］.Sci?ence，2008，322（5909）：1766－1767.

［2］ TakahashiK，YamanakaS.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663－676.

［3］ Yu J，VodyanikMA，Smuga－Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318（5858）：1917－1920.

［4］ Esteban MA，WangT，Qin B，et al.Vitamin C enhances the gen?eration of mouse and human induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2010，6（1）：71－79.

［5］ Huangfu D，Maehr R，Guo W，et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small－mole?cule compounds［J］.Nat Biotechnol，2008，26（7）：795－797.

［6］ IchidaJ K，Blanchard J，Lam K，et al.A small－molecule inhibi?tor of tgf－Beta signaling replaces sox2 in reprogramming byinducingnanog［J］.Cell Stem Cell，2009，5（5）：491－503.

［7］ Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline－com?petent induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2007，448（7151）：313－317.

［8］ Martinez－Fernandez A，Nelson TJ，Yamada S，et al.iPS pro?grammed without c－MYC yield proficient cardiogenesis for functional heart chimerism［J］.Circ Res，2009，105（7）：648－656.

［9］ Robinton DA，Daley GQ.The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy［J］.Nature，2012，481（7381）：295－305.

［10］ Kim D，Kim CH，Moon JI，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4（6）：472－476.

［11］ Narazaki G，Uosaki H，Teranishi M，et al.Directed and system?atic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced plu?ripotent stem cells［J］.Circulation，2008，118（5）：498－506.

［12］ Zwi L，Caspi O，Arbel G，et al.Cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells［J］.Circulation，2009，120（15）：1513－1523.

［13］ Zhang J，Wilson GF，Soerens AG，et al.Functionalcardiomyo?cytes derived from human induced pluripotent stem cells［J］.Circ Res，2009，104（4）：e30－41.

［14］ Ma J，Guo L，F(xiàn)iene SJ，et al.High purity human－induced pluri? potent stem cell－derived cardiomyocytes：electrophysiological properties of action potentials and ionic currents［J］.Heart Circ Physiol，2011，301（5）：H2006－2017.

［15］ Yang L，Soonpaa MH，Adler ED，et al.Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR＋embryonic－stem－cell－de?rived population［J］.Nature，2008，453（7194）：524－528.

［16］ Nelson TJ，MartinezFernandez A，Yamada S，et al.Repair of a?cute myocardia1 infarction by human stenmess factors induced pluripotent stem cells［J］.Circulation，2009，120（5）：408－416.

［17］ Mauritz C，Martens A，Rojas SV，et al.Induced pluripotent stem cell（iPSC）derived Flk 1 progenitor cells engraft，differentiateand improve heart function in a mouse model of acute myocardial in?farction［J］.Eur Heart J，2011，32（21）：2634－2641.

［18］ Zhang F，Song G，Li X，et al.Transplantation of induced pluri?potent stem cells ameliorates neural remodeling and reduces ven?tricular arrhythmias in a post－infarcted swine model［J］.J Cell Biochem，2014，115（3）：531－539.

［19］ Yan B，Singla DK.Transplanted Induced Pluripotent Stem Cells Mitigate Oxidative Stress and Improve Cardiac Function through the Akt Cell Survival Pathway in Diabetic Cardiomyopathy［J］.Mol Pharm，2013，10（9）：3425－3432.

［20］ Yamada S，Nelson T，KaneG，et al.iPS Cell Intervention Rescues Wall Motion Disparity Achieving Biological Cardiac Resynchroniza?tion Post－Infarction［J］.J Physiol，2013，591（Pt 17）：4335－4349.

［21］ Moretti A，Bellin M，Welling A，et al.Patient－specific induced pluripotent stem cell models for long－QT syndrome［J］.N Engl J Med，2010，363（15）：1397－1409.

［22］ Itzhaki I，Maizels L，Huber I，et al.Modelling the long QT syn?drome with induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2011，471（7337）：225－229.

［23］ Bellin M，Casini S，Davis RP，et al.Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long－QT syndrome［J］.EMBO J，2013，32（24）：3161－3175.

［24］ Ma D，Wei H，Zhao Y，et al.Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient－specific induced pluri?potent stem cells［J］.Int J Cardiol，2013，168（6）：5277－5286.

［25］ CaspiO，Huber I，GepsteinA，etal.Modeling of Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy with Human Induced Pluripo?tent Stem Cells［J］.CircCardiovasc Genet.2013 Nov 7.［Epub a?head of print］.

［26］ Zhang XH，Haviland S，Wei H，et al.Ca2＋signaling in human induced pluripotent stem cell－derived cardiomyocytes（iPS－CM）from normal and catecholaminergic polymorphic ventricular tachy?cardia（CPVT）－afflicted subjects［J］.Cell Calcium，2013，54（2）：57－70.

［27］ Ma Z，Koo S，F(xiàn)innegan MA，et al.Three－dimensional filamen?tous human diseased cardiac tissue model［J］.Biomaterials，2014，35（5）：1367－1377.

［28］ Navarrete EG，Liang P，Lan F，et al.Screening drug－induced arrhythmia events using human induced pluripotent stem cell－de?rived cardiomyocytes and low－impedance microelectrode arrays［J］.Circulation，2013，128（11 Suppl 1）：S3－13.

［29］ Guo L，Coyle L，Abrams RM，et al.Refining the human iPSC－cardiomyocyte arrhythmic risk assessment model［J］.Toxicol Sci，2013，136（2）：581－594.

［30］ Mandel Y，Weissman A，Schick R，et al.Human embryonic and induced pluripotent stem cell–derived cardiomyo－cytes exhibit beat rate variability and power－law behavior［J］.Circulation，2012，125（7）：883－893.

［31］ Kuzmenkin A，Liang H，Xu G，et al.Functional characterization of cardiomyocytes derived from murine induced pluripotent stem cells in vitro［J］.FASEB J，2009，23（12）：4168－4180.

［32］ Jiang P，Rushing SN，Kong CW，et al.Electrophysiological properties of human induced pluripotent stem cells［J］.Am J PhysiolCell Physiol，2010，298（3）：C486－495.

［33］ Kleger A，Seufferlein T，Malan D，et al.Modulation of calciumactivated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker－like cells［J］.Circula?tion，2010，122（18）：1823－1836.

［34］ Zhu WZ，Xie Y，Moyes KW，et al.Neuregulin／ErbB Signaling regulates cardiac subtype specification in differentiating human embryonic stem cells［J］.Circ Res，2010，107（6）：776－786.

［35］ Ben－David U，Benvenisty N.The tumorigenicity of human embry?onic and induced pluripotent stem cells［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（4）：268－277.

2014?06?28）

2014?06?30）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.03.19

國家自然科學基金面上項目（81271707，81371692）

200433上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院胸心外科

張 浩，E－mail：dr.zhghao＠gmail.com