瓜子金總皂苷的含量測定及其純化工藝研究Δ

王洪蘭，張亞楠，陳麗紅，李 祥#（.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 0046；.第二軍醫(yī)大學(xué)航海與潛水醫(yī)學(xué)教研室，上海 00433）

瓜子金始載于《植物名實(shí)圖考》，又名小遠(yuǎn)志、地藤草、銀不換，是遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物瓜子金（Polygala japonicaHoutt.）的全草，主要分布于我國南方各省[1]。瓜子金味苦、微辛，性平，能鎮(zhèn)咳祛痰、益智安神、活血散瘀，民間應(yīng)用十分普遍且療效顯著。瓜子金中的化學(xué)成分包括三萜皂苷、黃酮、寡糖酯等，已有研究表明，瓜子金中的三萜皂苷類化合物具有顯著的生理活性[2-6]。大孔吸附樹脂是一類非離子型高分子化合物，具有吸附性和篩選性相結(jié)合的分離、純化等功能，近年來在藥學(xué)領(lǐng)域特別是天然藥物精制中應(yīng)用日益廣泛，成為純化中藥有效成分的一種有效方法[7-10]。本研究以吸附容量、洗脫率、精制度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察大孔吸附樹脂純化瓜子金總皂苷的工藝條件，進(jìn)一步探索純化瓜子金總皂苷的工藝流程。

1 材料

1.1 儀器

752型紫外-可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；420型三用恒溫水箱（江蘇國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠）；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器設(shè)備廠）；EK-182A型電子分析天平（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材

瓜子金購于江蘇省藥材有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為真品，憑證標(biāo)本（GZJ-PJ-2010-09）存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室。

1.3 試劑

瓜子金總皂苷對照品（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，純度：＞95%）；D101，AB-8大孔樹脂（南開大學(xué)化工廠）；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 瓜子金醇提物的制備

取瓜子金藥材飲片9kg，乙醇回流提取3次，濃縮得總浸膏約1500g。

2.2 總皂苷含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取瓜子金總皂苷對照品50.0mg，置10ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液（每1ml中含瓜子金總皂苷對照品5mg）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取瓜子金醇提物浸膏2.0 g，加水50ml 溶解后，用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并水層，轉(zhuǎn)移至量瓶并定容至100ml，即得供試品溶液。

2.2.3 測定波長的選擇 精密量取供試品溶液0.25ml和對照品溶液0.2ml，分別置10ml 具塞試管中，水浴揮干溶劑，分別加入0.2ml 的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml 高氯酸，搖勻，置于60℃水浴中加熱15min，冷卻后分別加入冰醋酸5ml，搖勻，放置10min，于紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行全波長掃描，隨行試劑作空白。掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在580nm 波長處均有較大吸收，故確定最適檢測波長為580nm。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取5.00mg/ml 對照品溶液0.10、0.20、0.30、0.35、0.40ml，置于5支具塞刻度試管中，隨行試劑作空白，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.3694x+0.1018（r＝0.9997）。結(jié)果表明，對照品進(jìn)樣量在0.5～2.0mg 范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對照品溶液0.2ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定，在580nm波長處測定吸光度，平行測定6次。結(jié)果，RSD＝0.41%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，精密量取0.25ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定，每隔10min測定吸光度，連續(xù)測定1h。結(jié)果，30min內(nèi)的RSD＝2.37%，表明供試品溶液在30min 內(nèi)穩(wěn)定，故測定時(shí)間最好控制在30min以內(nèi)。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密量取0.25ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定。結(jié)果，RSD＝1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份樣品粉末各1.0g，分別加入一定量的對照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，精密量取0.25ml，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，平均加樣回收率為99.51%，RSD＝2.92%。

2.2.9 樣品含量測定 分別精密稱取3份瓜子金醇提物浸膏2.0g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備得3份供試品溶液，分別精密量取0.25ml，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色并進(jìn)行紫外測定，計(jì)算總皂苷含量。結(jié)果表明，瓜子金總皂苷的平均含量為20.88%，RSD＝0.89%。

2.3 瓜子金總皂苷的純化工藝研究

2.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理、裝柱與再生 將D-101、AB-8兩種型號(hào)樹脂均用95%乙醇浸泡24h后，濕法裝柱，用5倍柱體積95%乙醇洗脫，水洗至無醇味，然后依次用5%鹽酸（浸泡6h，洗脫3倍柱體積，水洗至中性）和5%氫氧化鈉（浸泡6h，洗脫3倍柱體積，水洗至中性）處理，之后用95%乙醇洗脫，至乙醇洗脫液與水1∶5（V/V）混合不呈白色混濁為止，最后水洗至無醇味，取部分濕樹脂備用。將剩余樹脂置真空干燥器中于熱力學(xué)溫度（T）333K干燥至恒質(zhì)量得干樹脂，備用。

2.3.2 大孔樹脂類型與選擇 大孔吸附樹脂常因類型不同，比表面積、孔徑、極性差異較大，由此決定的吸附容量也有較大的差異[11-12]。本研究以吸附容量為指標(biāo)，對D101、AB-8大孔吸附樹脂的吸附能力進(jìn)行考察，以確定富集、純化瓜子金總皂苷的大孔吸附樹脂類型。分別取上述處理得到的大孔樹脂D101、AB-8各10g（干質(zhì)量），以蒸餾水濕法裝柱（一柱床約100ml），精密量取瓜子金醇提物溶液各10ml，分別上樣于上述兩種樹脂柱內(nèi)，預(yù)吸附2h，流速1BV/h（BV為柱床體積），過柱流出液重吸附2次，收集流份。測定流份中瓜子金總皂苷含量，比較樹脂吸附量。結(jié)果表明，D101大孔吸附樹脂吸附量較大，故選擇D101大孔吸附樹脂純化、富集瓜子金總皂苷。D101、AB-8兩種樹脂吸附能力比較見表1。

表1 D101、AB-8兩種樹脂吸附能力比較（mg）Tab 1 Comparison of adsorption ability between D101 and AB-8（mg）

2.3.3 洗脫溶媒的確定 精密量取瓜子金醇提取物供試品溶液10ml，依次用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4BV洗脫，洗脫速度1BV/h，按1BV/份（100ml）收集流份。測定各流份中瓜子金總皂苷含量，計(jì)算洗脫率。結(jié)果表明，50%乙醇和70%乙醇洗脫部位為瓜子金總皂苷類成分的主要存在部位，且70%乙醇洗脫能力強(qiáng)于50%乙醇，故確定以70%乙醇作為瓜子金總皂苷類成分的洗脫溶媒。蒸餾水、30%乙醇洗脫時(shí)均有一定量的固形物存在（但是因?yàn)楹勘容^少，無法每份流液均測得固體物具體含量，僅目測發(fā)現(xiàn)）。表明蒸餾水、30%乙醇洗脫可達(dá)到除雜的目的。不同濃度乙醇洗脫試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2[洗脫率＝洗脫液中總評(píng)苷量/樹脂吸附總皂苷量×100%]。

2.3.4 洗脫溶媒用量的確定 精密量取瓜子金醇提物供試品溶液10ml，依法上柱，依次用蒸餾水3BV，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4BV洗脫，洗脫速度1BV/h，以1BV/份收集流份。測定各流份中瓜子金總皂苷含量，計(jì)算洗脫率并測定固形物量。結(jié)果表明，蒸餾水洗脫用量至1BV 時(shí)，極少部分瓜子金總皂苷析出；30%乙醇洗脫用量至4BV時(shí)，在流份中未檢出瓜子金總皂苷；但30%乙醇洗脫至3BV時(shí)有明顯的固形物存在；而洗脫用至4BV時(shí)未發(fā)現(xiàn)固形物。表明30%乙醇洗脫可達(dá)到除雜質(zhì)的目的，并且可以初步確定30%乙醇用量為3BV。70%乙醇洗脫用量至2BV時(shí)，瓜子金總皂苷已基本被解吸附完全；當(dāng)70%乙醇用量至3BV時(shí)，流出液中未檢出皂苷類成分，但為了保證洗脫完全，故將乙醇用量加至3BV。進(jìn)一步確定了洗脫溶媒用量為蒸餾水3BV、30%乙醇、70%乙醇各3 BV，收集70%乙醇洗脫部位。洗脫溶媒用量的確定見表3。

表2 不同濃度乙醇洗脫試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab 2 Elution test of ethanol with different concentrations

綜上所述，初步確定最佳工藝為D101大孔吸附樹脂純化瓜子金總皂苷，蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3BV 以1BV/h速度依次洗脫，收集70%乙醇洗脫部位。

表3 洗脫溶媒用量的確定Tab 3 The amount of elution solvent

2.3.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 精密量取瓜子金醇提物溶液10ml，依法上柱，平行2份，分別用蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3BV洗脫，洗脫速度1BV/h，以1BV/份收集流份。測定各流份中瓜子金總皂苷含量、固形物量，計(jì)算洗脫率及精制度。蒸餾水僅能夠洗脫出少量的總皂苷，30%乙醇洗脫部位未檢出瓜子金總皂苷，但30%乙醇洗脫部位有固形物存在，表明達(dá)到了除雜、純化的目的。70%乙醇洗脫部位總皂苷洗脫率71.53%，為其主要富集部位，且精制度達(dá)343.30%，純化效果較好，表明所選工藝條件適宜瓜子金總皂苷的富集、純化且重現(xiàn)性良好。工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果見表4[瓜子金總皂苷精制度＝（70%乙醇洗脫液固形物中總皂苷含量/瓜子金上柱液固形物中總皂苷含量）×100%]。

表4 工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of technique parameter validation test

3 討論

皂苷類成分大多無色，在近紫外區(qū)無明顯吸收峰，但與某些試劑反應(yīng)后能產(chǎn)生顏色，利用這一性質(zhì)可進(jìn)行比色測定[12]。本次紫外分光光度法測定瓜子金總皂苷含量發(fā)現(xiàn)，瓜子金總皂苷在一定范圍內(nèi)均顯示較好的線性關(guān)系（r＝0.9997）；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果顯示，其RSD 值均小于3.00%，回收率平均值為99.51%。使用紫外分光光度法測定瓜子金中總皂苷含量快速、準(zhǔn)確。紫外分光光度法測定瓜子金總皂苷雖然反應(yīng)比較靈敏、方法簡單易行，但反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色受試劑的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等影響較大，因此試驗(yàn)過程中必須注意反應(yīng)條件的控制。

大孔樹脂吸附法是一種工藝簡單、操作安全、節(jié)省成本且分離效果較好的分離方法。大孔吸附樹脂是利用大孔樹脂的多孔結(jié)構(gòu)和樹脂的選擇性吸附功能，從中藥提取液中分離精制有效成分或有效部位的技術(shù)，它既有物理吸附作用，又因多孔狀結(jié)構(gòu)而能選擇性篩析，所以在中藥的總皂苷純化富集工藝中有良好的發(fā)展前景。結(jié)果顯示，大孔樹脂70%醇洗部位總皂苷含量為71.68%，洗脫率可達(dá)71.53%。本研究得出純化瓜子金總皂苷的工藝條件為D101大孔樹脂純化瓜子金總皂苷，蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇3BV，以1BV/h 速度依次洗脫，收集70%乙醇洗脫部位。

[1]劉賢銘，王鐵僧，姚淦.江浙閩臺(tái)地區(qū)遠(yuǎn)志類藥用植物資源整理及鑒定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（2）：243.

[2]Li TZ，Zhang WD，Yang GJ，et al.Saponins from Polygala japonica and their effects on a forced swimming test in mice[J].J Nat Pro，2006，69（4）：591.

[3]Wang HL，Gao J，Zhu DN.Anti-inflammatory activities of triterpenoid saponins from Polygala japonica[J].Phytomedicine，2008，15（5）：321.

[4]趙清超，黃顯章，胡久略，等.瓜子金有效部位群抗炎作用機(jī)制研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（2）：131.

[5]吳苗苗，苑玉和，胡金鳳，等.瓜子金皂苷己對MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（4）：473.

[6]Sun F，Sun JD，Han N，et al.Polygalasaponin F induces long-term potentiation in adult rat hippocampus via NMDA receptor activation[J].Acta Pharm Sin，2012，33（4）：431.

[7]侯杰榮，谷勇，柯發(fā)敏，等.大孔吸附樹脂技術(shù)在中藥有效成分分離中的應(yīng)用[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2011，27（5）：344.

[8]歐陽麗娜，吳雪，李蘭林，等.大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參總皂苷工藝條件優(yōu)選[J].中成藥，2011，33（7）：1163.

[9]張旭，王錦玉，仝燕，等.大孔樹脂技術(shù)在中藥提取純化中的應(yīng)用及展望[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：286.

[10]賀紅軍，邱宗蔭.正交試驗(yàn)優(yōu)選茅莓總皂苷的提取工藝[J].中國藥房，2012，23（7）：611.

[11]李崇明，熊富良，黃志軍，等.新藥研究中大孔吸附樹脂型號(hào)與規(guī)格的選擇應(yīng)用[J].中成藥，2008，30（8）：1208.

[12]蔡寶昌.中藥分析學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：190.