聚乙二醇對鹽酸伊立替康脂質(zhì)體體外釋放及在不同稀釋介質(zhì)中穩(wěn)定性的影響

李 哲，馬海英（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110032）

鹽酸伊立替康（Irinotecan hydrochloride，CPT-11）是喜樹堿的半合成衍生物，具有較好的水溶性，是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的特異性抑制劑。CPT-11為一種前藥，在肝臟羧酸酯酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚援a(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿，從而產(chǎn)生抗癌作用；臨床上用于非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和卵巢癌的治療[1]，對其他腫瘤如乳腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌也有一定的效果。與其他抗腫瘤藥物相同，CPT-11也具有明顯的毒性，不良反應(yīng)主要包括中性粒細(xì)胞及白細(xì)胞減少、骨髓抑制和胃腸道功能紊亂等[2-3]。脂質(zhì)體作為藥物載體，具有優(yōu)良的生物相容性、對組織和細(xì)胞的靶向性以及提高藥物的治療指數(shù)與降低藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，而聚乙二醇（PEG）化脂質(zhì)體又具有減弱脂質(zhì)體長期貯存的聚集性、增加再分散性、延長體循環(huán)時間、提高半衰期、降低不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，PEG修飾的CPT-11脂質(zhì)體能夠減輕毒副反應(yīng)，同時增加腫瘤組織內(nèi)藥物的分布，提高其抗腫瘤效果[7]。目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的CPT-11脂質(zhì)體即以PEG修飾的[8]，但PEG修飾的CPT-11脂質(zhì)體中PEG對脂質(zhì)體的釋放和在不同稀釋介質(zhì)中穩(wěn)定性的影響并未見相關(guān)報(bào)道。筆者以乙二胺四乙酸銨梯度法制備CPT-11脂質(zhì)體，考察不同PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）含量對脂質(zhì)體體外釋放及在不同稀釋介質(zhì)中穩(wěn)定性的影響，為PEG化脂質(zhì)體研究與開發(fā)、臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Nicomp-380粒度測定儀（美國Particle Sizing Systems公司）；756MC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；Anke TDL80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，離心半徑：50 mm）；PHS-2C型數(shù)字顯示酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；透析袋（上海滬宇生物科技公司，截留分子質(zhì)量：8 000～14 000）；DF-101S磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；732型陽離子交換樹脂、717型陰離子交換樹脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 藥品與試劑

CPT-11原料藥（成都元成生物科技有限公司，批號：20100712，純度：≥99.0%）；氫化大豆磷脂（德國Lucas Meyer公司，批號：201112S12，純度：＞99.8%）；膽固醇（南京新百藥業(yè)有限公司，批號：20100302）；mPEG2000-DSPE（美國Genzyme公司，批號：Z1202X，純度：＞99.8%）；CPT-11對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：20110812，純度：＞99.9%）；生理氯化鈉溶液、5%葡萄糖注射液（沈陽志鷹制藥廠）；乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 CPT-11脂質(zhì)體的制備

采用乙二胺四乙酸銨梯度法，精密稱取氫化大豆磷脂-膽固醇（3 ∶1，W/W）各5份，制備成PEG2000質(zhì)量濃度為0、8、14、20、26 mg/ml的mPEG2000-DSPE的空白脂質(zhì)體。將所得空白脂質(zhì)體混懸液依次通過0.8、0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行整粒。采用陰陽混合離子交換樹脂建立梯度，取0.1 ml梯度脂質(zhì)體，向其中加入6 mg/ml的CPT-11溶液0.3 ml，65 ℃水浴孵化10 min，得CPT-11脂質(zhì)體。

2.2 CPT-11脂質(zhì)體包封率的測定方法[9]

采用陽離子交換樹脂分離-紫外分光光度法測定CPT-11脂質(zhì)體的包封率（E）。取已制備好的CPT-11脂質(zhì)體100 μl 2份，一份以體積分?jǐn)?shù)為90%的異丙醇（含0.75 mol/L鹽酸）溶液稀釋至25 ml量瓶中，搖勻，372 nm波長處測定脂質(zhì)體混懸液中所含藥物的吸光度值（Atot）；另一份上樣于陽離子交換樹脂柱頂端，2 000 r/min離心4 min，繼續(xù)加200 μl重蒸水于柱的頂端，2 000 r/min離心4 min洗脫，合并洗脫液，以90%異丙醇（含0.75 mol/L鹽酸）溶液稀釋，372 nm波長處測定包封于脂質(zhì)體內(nèi)藥物的吸光度值（Alip）。根據(jù)公式E＝Alip/Atot×100%計(jì)算包封率。

2.3 CPT-11脂質(zhì)體包封率及粒徑的測定

取制備好的含0、8、14、20、26 mg/ml的mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體各適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法測定包封率。另取制得的CPT-11脂質(zhì)體分別以滅菌注射用水稀釋，使光密度值在250～350，放入樣品池內(nèi)，采用基于動態(tài)光散射原理的Nicomp-380粒度測定儀測定脂質(zhì)體的粒徑。試驗(yàn)重復(fù)測定3次，包封率和粒徑的結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度mPEG2000-DSPE對CPT-11脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響（n＝3）Tab 1 Effects of different concentrations of mPEG2000-DSPE on entrapment efficiency and particle sizes of CPT-11 liposomes（n＝3）

2.4 CPT-11脂質(zhì)體的體外釋放度考察

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（PBS，即磷酸二氫鉀6.8 g，以800 ml水溶解，加入三乙胺10 ml，以磷酸溶液調(diào)pH至4.0，加水至1 000 ml）（55 ∶5 ∶45），流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μl。在該色譜條件下，空白輔料對CPT-11的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白輔料；B.空白輔料+對照品；C.CPT-11脂質(zhì)體；1.CPT-11Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.blank excipients+substance control；C.CPT-11 liposomes；1.CPT-11

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備?？紤]到CPT-11水溶液釋放速度很快，8 h即釋放100%，而CPT-11脂質(zhì)體釋放較慢，0.5 h的累積釋放率極少，濃度跨度范圍較大，因此為了更好地確定線性范圍，筆者做了高、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：以50.0 μg/ml的CPT-11水溶液作為貯備液，精密量取貯備液0.04、0.1、0.15、0.2、0.3 ml，分別置于10 ml量瓶中，用pH7.4的PBS稀釋至刻度，搖勻，制得0.2、0.5、0.75、1.0、1.5 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：A＝31.013c－3.750 1（r＝0.999 5），表明CPT-11檢測低質(zhì)量濃度的線性范圍為0.2～1.5 μg/ml。（2）高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取貯備液0.3、1.0、3.0、6.0、8.0 ml，用pH 7.4的PBS稀釋制成1.5、5.0、15.0、30.0、40.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：A＝48.529c－71.363（r＝0.999 6），表明CPT-11檢測高質(zhì)量濃度的線性范圍為1.5～50.0 μg/ml。

2.4.3 精密度試驗(yàn)。將低質(zhì)量濃度線性方程的0.5、1.0、1.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液及高質(zhì)量濃度線性方程的1.5、15.0、50.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液各連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果上述質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中CPT-11含量的RSD分別為1.64%、1.80%、1.20%、1.20%、1.70%、0.80%（n＝6）。

2.4.4 回收率試驗(yàn)。取低質(zhì)量濃度線性方程的0.5、1.0、1.5 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液及高質(zhì)量濃度線性方程的1.5、15.0、50.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定峰面積，代入回歸方程計(jì)算CPT-11濃度，由測定濃度和實(shí)際濃度計(jì)算回收率。結(jié)果上述質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的CPT-11回收率分別為101.64%、100.59%、99.24%、99.24%、98.18%、101.26%，RSD分 別 為1.53%、1.80%、1.16%、1.16%、0.91%、0.89%。

2.4.5 體外釋放度的測定。分別精密吸取CPT-11水溶液（簡稱A）和含mPEG2000-DSPE分別為0、8、14、20、26 mg/ml的CPT-11脂質(zhì)體（簡稱B、C、D、E、F），加入預(yù)處理過的透析袋中，夾好后置于100 ml pH7.4的PBS中。避光，37 ℃恒溫、恒速攪拌，分別于第0.5、1、2、4、6、8、10、24小時吸取2 ml透析液，并補(bǔ)加等量PBS。透析液通過0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定CPT-11含量，按照公式計(jì)算累積釋放度（Rn），公式為，式中，V0為釋放介質(zhì)體積，cn為第n次取樣時質(zhì)量濃度，V為取樣體積，Mt為總的藥物濃度。以累積釋放度對時間作圖，釋放曲線見圖2。

圖2 CPT-11溶液和不同CPT-11脂質(zhì)體的釋放曲線Fig 2 Release curves of CPT-11 solution and different CPT-11 liposomes

由圖2可知，CPT-11水溶液在0.5 h釋放約42%、6 h釋放達(dá)90%以上、8 h即釋放完全，顯著大于CPT-11脂質(zhì)體；在CPT-11脂質(zhì)體中，不含mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體0.5 h釋放約12%、24 h釋放21.18%，明顯高于其余含mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體（累積釋放度均低于15%）。當(dāng)mPEG2000-DSPE含量為8 mg/ml時，CPT-11脂質(zhì)體的0.5 h累積釋放度為9%，較不含的脂質(zhì)體減小了約3%，可見加入mPEG2000-DSPE可減慢CPT-11脂質(zhì)體的體外釋放速率；但8 mg/ml還不足以使累積釋放度降到最低，隨著mPEG2000-DSPE含量增加到14 mg/ml才基本達(dá)到平臺值（0.5 h累積釋放度為7.92%），mPEG2000-DSPE含量繼續(xù)增加而0.5 h累積釋放率基本不再變化。

2.5 CPT-11脂質(zhì)體在不同稀釋介質(zhì)中的穩(wěn)定性研究

2.5.1 測定及計(jì)算方法。取含0、8、14、20、26 mg/ml mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體，分別取0.5、1.0、2.5 ml于3個5 ml量瓶中，以生理氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即分別稀釋10、5、2倍，分別放置0、2、4、6、8、24 h后測定上述溶液的包封率及粒徑。另外用5%葡萄糖注射液代替生理氯化鈉溶液，重復(fù)上述操作測定包封率和粒徑。

2.5.2 對包封率的影響。不同CPT-11脂質(zhì)體經(jīng)生理氯化鈉溶液或5%葡萄糖注射液稀釋不同倍數(shù)后的包封率結(jié)果見表2。由表2可知，不含mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體，采用兩種介質(zhì)稀釋后，包封率變化顯著，且隨稀釋倍數(shù)的增加包封率逐漸降低。當(dāng)CPT-11脂質(zhì)體中mPEG2000-DSPE含量較低時（8、14 mg/ml），采用兩種介質(zhì)稀釋后，隨稀釋倍數(shù)的增加及時間的延長，包封率有所降低。當(dāng)mPEG2000-DSPE含量的增加至20 mg/ml時，包封率基本不再變化。

表2 CPT-11脂質(zhì)體經(jīng)生理氯化鈉溶液或5%葡萄糖注射液稀釋不同倍數(shù)后的包封率（%）Tab 2 Entrapment efficiency of different CPT-11 liposomes by diluting with physiological solution of sodium chloride or 5%Glucose injection with different dilution times（%）

2.5.3 對粒徑分布的影響。不同CPT-11脂質(zhì)體經(jīng)生理氯化鈉溶液或5%葡萄糖注射液稀釋不同倍數(shù)后的粒徑結(jié)果見表3。由表3可知，mPEG2000-DSPE含量較低時（0、8、14 mg/ml），可使脂質(zhì)體的粒徑不同程度增加；mPEG2000-DSPE含量較高時（20、26 mg/ml），對脂質(zhì)體粒徑基本無明顯影響。

3 討論

脂質(zhì)體作為藥物傳遞系統(tǒng)，由于其具有靶向性、較高的器官分布選擇性，能提高藥物的療效和減少毒副作用，所以成為藥物制劑研究的熱點(diǎn)。但是普通脂質(zhì)體存在聚集融合、磷脂成分可與血液中的高密度脂蛋白的載脂蛋白A-1發(fā)生互換，以及易被單核巨噬細(xì)胞系快速清除而使藥物不能到達(dá)靶部位有效發(fā)揮作用等問題。通過PEG修飾解決了普通脂質(zhì)體的上述問題。mPEG2000-DSPE為一種PEG脂質(zhì)衍生物，其兩親性的高分子化合物可在脂質(zhì)體表面形成蘑菇狀、毛刷狀的位阻層，具有空間位阻作用，降低了脂質(zhì)體之間的聚集和融合，提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。因mPEG2000-DSPE中含有PEG，具有較高的親水性，使得磷脂頭基周圍產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，增大了膜表面的側(cè)向排斥力，故可減小脂質(zhì)體的粒徑[11]。本試驗(yàn)證實(shí)了隨著mPEG2000-DSPE濃度的增大，其修飾脂質(zhì)體粒徑減??；當(dāng)mPEG2000-DSPE濃度為20 mg/ml時，再繼續(xù)增加PEG的濃度，脂質(zhì)體粒徑略有增大。這可能是由于mPEG2000-DSPE在磷脂頭基產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，雙分子層表面?zhèn)认蚺懦饬υ龃?，阻止了脂質(zhì)體之間的聚集與融合，脂質(zhì)體粒徑減??；但當(dāng)mPEG2000-DSPE含量達(dá)到一定程度時，mPEG2000-DSPE在脂質(zhì)體表面數(shù)量達(dá)到飽和，脂質(zhì)體熱穩(wěn)定性達(dá)到最佳狀態(tài)，再繼續(xù)增加mPEG2000-DSPE含量不但不能減小脂質(zhì)體粒徑，反而使粒徑略有增加。此結(jié)果與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道一致，其也發(fā)現(xiàn)隨著mPEG2000-DSPE含量增大，脂質(zhì)體粒徑先減小后增大。

表3 不同CPT-11脂質(zhì)體經(jīng)生理氯化鈉溶液或5%葡萄糖注射液稀釋不同倍數(shù)后的粒徑（nm）Tab 3 Particle size of CPT-11 liposomes by diluting with physiological solution of sodium chloride or 5% Glucose injection with different dilution times（nm）

由于mPEG2000-DSPE在脂質(zhì)體表面形成一定厚度的水化層，起到了屏障作用，減弱了血漿成分對脂質(zhì)體的破壞與吸附作用，從而降低單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）的攝取量，延長了血液循環(huán)半衰期，阻礙了藥物的釋放，使藥物在脂質(zhì)體中有一定的貯留[13]。因此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不含mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體的24 h體外累積釋放度大于其他含mPEG2000-DSPE的CPT-11脂質(zhì)體。

由于脂質(zhì)體制劑多作為注射劑，臨床使用前多采用稀釋后給藥的方法，以滿足劑量、滲透壓等要求。稀釋時，稀釋介質(zhì)與制劑直接接觸，可能會對脂質(zhì)體制劑的一些性質(zhì)產(chǎn)生影響。本文考察了CPT-11脂質(zhì)體在5%葡萄糖注射液和生理氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)采用兩種稀釋介質(zhì)稀釋后，隨著mPEG2000-DSPE含量的增加，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性增加，包封率及粒徑變化減小。

[1]陳果，彭健，何穎，等.伊立替康長循環(huán)脂質(zhì)體的初步生物學(xué)活性研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（9）：18.

[2]于秋影，王慧玲，武曈，等.1例鹽酸伊立替康嚴(yán)重不良反應(yīng)的病例分析[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（9）：733.

[3]鄭慶梅，韓景賓，宮新江，等.鹽酸伊立替康脂質(zhì)體臨床前藥代動力學(xué)、耐受性和藥效學(xué)研究[J].中國新藥雜志，2012，21（14）：1 591.

[4]楊付英，陳和莉，張文萍，等.鹽酸伊立替康納米粒的制備及體外評價[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（21）：1 723.

[5]楊鵬波，張華.脂質(zhì)體的研究新進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（7）：936.

[6]張小洪，王建華.修飾性脂質(zhì)體材料及其藥學(xué)應(yīng)用研究[J].化工新型材料，2013，41（5）：2 153.

[7]樊繼濤，曹海強(qiáng)，劉澤瑩，等.鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的制備及體外抗腫瘤活性[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（6）：576.

[8]Drummond DC，Noble CO，Guo Z，et al.Development of a highly active nanoliposomal irinotecan using a novel intraliposomal stabilization strategy[J].Cancer Res，2006，66（6）：3 271.

[9]張玲，黃微葳，王健，等.重酒石酸長春瑞濱脂質(zhì)體包封率測定方法比較[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（2）：105.

[10]仵文英，李莎，徐曉娜，等.苦參堿脂質(zhì)體的穩(wěn)定性及體外釋放度研究[J].中國藥房，2013，24（37）：3 542.

[11]Garbuzenko O，Barenholz Y，Priev A.Effect of grafted PEG on liposome size and on compressibility and packing of lipid bilayer[J].Chem Phys Lipids，2005，135（2）：117.

[12]徐洋，石莉，鄧意輝.聚乙二醇-脂質(zhì)衍生物修飾對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（10）：1 178.

[13]Xu H，Deng Y，Chen D，et al.Esterase-catalyzed dePEGylation of pH-sensitive vesicles modidied with cleavable PEG-lipid derivatives[J].J Control Release，2008，130（3）：238.