利福布汀的合成工藝改進(jìn)

葉 祥，周 晶，何 菱，齊慶蓉#（.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都 6004；2.四川省基本藥物集中采購(gòu)服務(wù)中心，成都 6004；3.四川省食品藥品安全監(jiān)測(cè)及評(píng)審認(rèn)證中心，成都 6007）

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，耐多藥肺結(jié)核對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)的危害極大[1]。利福布汀能干擾結(jié)核桿菌的脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）合成，對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性和陰性菌均有抗菌活性，特別是對(duì)結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌；對(duì)非典型分枝桿菌鳥(niǎo)分枝桿菌-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體（MAC）的抗菌活性超過(guò)利福平；利福平耐藥性分枝桿菌對(duì)利福布汀無(wú)完全交叉耐藥性，30%以上菌株對(duì)利福布汀仍然敏感。利福布汀在藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)上均顯著優(yōu)于利福平[2-4]。利福布汀與許多抗菌藥包括抗結(jié)核藥聯(lián)用具有協(xié)同和促進(jìn)作用，是目前重要的抗結(jié)核藥物之一。文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道，利福布汀的合成路線只有1條，均以利福霉素S為起始原料，經(jīng)溴代、硝基化、還原、亞氨基化，最后與側(cè)鏈環(huán)合得利福布汀。筆者對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的工藝線路進(jìn)行重現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品收率未達(dá)到報(bào)道的收率，而且產(chǎn)品純度不高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)可能是反應(yīng)溶劑在未經(jīng)相關(guān)前處理、反應(yīng)溫度設(shè)定不佳等條件下易導(dǎo)致反應(yīng)收率低、雜質(zhì)多，故本文針對(duì)反應(yīng)溶劑的前處理、反應(yīng)溫度以及側(cè)鏈N-異丁基哌啶酮的制備工藝進(jìn)行了研究改進(jìn)。改進(jìn)后利福布汀的合成路線見(jiàn)圖1，側(cè)鏈N-異丁基哌啶酮的合成路線見(jiàn)圖2。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀、1946B ESI-MS型質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；INOVA-400核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司）。

1.2 藥品與試劑

利福霉素S（臺(tái)州市中榮化工有限公司，批號(hào)：120613，純度：99.22%）；異丁胺、丙烯酸乙酯（成都長(zhǎng)征化學(xué)試劑公司，批號(hào)：201203152、201110037，純度：99.5%、99%）；4-哌啶酮鹽酸鹽（常州尚科醫(yī)藥化工材料有限公司，批號(hào)：20120829，純度：99.30%）；異丁基溴（鹽城市云峰化工有限公司，批號(hào)：20120157，純度：98.85%）；其余試劑均為分析純。

圖1 利福布汀的合成路線Fig 1 The synthetic route of rifabutin

圖2 側(cè)鏈N-丁基哌啶酮的合成路線Fig 2 The synthetic route of the side chainN-butyl piperidone

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)方法

2.1.1 薄層層析（TLC）法。3-溴利福霉素S（化合物1）和3-硝基利福霉素S（化合物2）的展開(kāi)劑為苯-乙酸乙酯-甲醇（20 ∶8 ∶7），其余的展開(kāi)劑為二氯甲烷-甲醇（9 ∶1）；薄層板為硅膠GF254化學(xué)純。

2.1.2 高效液相色譜法。色譜柱為L(zhǎng)ichro-spherR100（RP-8，5.0 μm×250 mm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.04 mol/L磷酸二氫鉀（54 ∶10 ∶36，V/V），流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5.0 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；內(nèi)標(biāo)為硝基苯酚。

2.2 化合物1的制備

將利福霉素S 40.00 g（0.057 5 mol）加入到700 ml 95%乙醇中，加熱回流，待溶解完全，冷卻至0 ℃以下，備用。另將吡啶12.6 ml（0.156 6 mol）加入到87 ml無(wú)水乙醇中，冷卻至0 ℃以下，慢慢滴加溴素4.4 ml（0.169 6 mol），控制反應(yīng)溫度5 ℃以下，滴加完后再加入到上述備用液中，于0～5 ℃反應(yīng)1 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全）。反應(yīng)液用二氯甲烷萃取、水洗滌萃取液、無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮至干，得化合物1粗品。

2.3 化合物2的制備

向化合物1粗品中加入90 ml二甲基甲酰胺（DMF），溶解后冷卻至0 ℃以下，滴加含亞硝酸鈉4.44 g（0.064 3 mol）的180 ml的DMF溶液，滴完后于0～5 ℃反應(yīng)2 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全）。將反應(yīng)液傾入5～10 ℃的580 ml 2%醋酸溶液中，再補(bǔ)加2 000 ml水，攪拌析晶2 h，濾過(guò)，水洗濾餅，固體于40 ℃干燥12 h得化合物2粗品23.75 g。將該粗品用190 ml無(wú)水乙醇精制，干燥得化合物2精品20.00 g，HPLC法檢測(cè)純度：98.71%，兩步收率：46.94%。

2.4 3-氨基利福霉素S（化合物3）的制備

將化合物2精品20.00 g（0.027 mol）溶于400 ml二氯甲烷中，在攪拌下加入鋅粉11.55 g（0.177 7 mol）。控制反應(yīng)液溫度10～20 ℃，滴加冰醋酸28.1 ml（0.491 8 mol），然后在室溫下反應(yīng)4 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全），濾過(guò)，少量二氯甲烷洗滌濾餅。濾液中加入活性二氧化錳12.80 g（0.147 1 mol），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h，濾過(guò)，濾液經(jīng)洗滌、干燥、濃縮后得22.40 g黏稠液體，即化合物3，直接用于下一步反應(yīng)。

2.5 3-氨基-4-亞氨基利福霉素S（化合物4）的制備

將化合物3黏稠液體22.40 g用80 ml乙二醇二甲醚溶解，加入冰醋酸0.9 ml，緩慢通入氨氣，于15～20 ℃反應(yīng)24 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全），濾過(guò)，少量乙二醇二甲醚洗滌濾餅。濾液減壓濃縮至干，再加入70 ml乙二醇單甲醚，冷卻攪拌析晶12 h，濾過(guò)，干燥得化合物4 11.00 g[兩步收率：57.46%；HPLC法檢測(cè)純度：98.93%；熔點(diǎn)（mp）＞250 ℃（分解）；文獻(xiàn)[8]報(bào)道該步收率：54.4%]。

同時(shí)，筆者按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，具體如下：將化合物315 g溶于100 ml無(wú)水四氫呋喃，室溫下通入氨氣，攪拌反應(yīng)34 h，向反應(yīng)液中加入200 ml二氯甲烷，再分別用100 ml 2%稀醋酸溶液和100 ml水洗，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，濾過(guò)，濾液減壓濃縮干，用50 ml乙二醇單甲醚結(jié)晶得到化合物47.4 g（收率：53.7%）。所得化合物收率和文獻(xiàn)報(bào)道一致，mp＞250 ℃（分解），HPLC法檢測(cè)純度：98.18%。

2.6 利福布汀的制備

將11.00 g（0.015 5 mol）化合物4溶于55 ml四氫呋喃中，再加入2.8 ml（0.016 3 mol）N-異丁基哌啶酮、0.55 g（0.008 5 mol）乙酸銨和0.55 g（0.007 1 mol）鋅粉，控制反應(yīng)液溫度在30 ℃左右，攪拌反應(yīng)1.5 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全），濾過(guò)。濾液中加入110 ml 2%醋酸水溶液，攪拌均勻后加入50 ml二氯甲烷，萃取，水層再用35 ml二氯甲烷萃取1次，合并二氯甲烷，分別用70 ml的2%醋酸水溶液、70 ml水、70 ml 5%碳酸氫鈉水溶液和70 ml 2%碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機(jī)層干燥、濃縮至干，加入350 ml石油醚（60-90系列），加熱回流30 min，趁熱濾過(guò)。濾液減壓濃縮至剩余少量液體（約35 ml）時(shí)停止，室溫放置12 h以上，濾過(guò)，60 ℃減壓干燥得到利福布汀8.00 g[紫紅色固體，收率：60.94%，HPLC法檢測(cè)純度：99.17%；mp＞250 ℃（分解）；文獻(xiàn)[8]報(bào)道收率：44.2%]。高分辨質(zhì)譜（HRMS）：通過(guò)m/z計(jì)算得分子式：C47H63N3O11；分子質(zhì)量：847.4575（加氫峰）、847.465 0（實(shí)驗(yàn)值）。

同時(shí)，筆者按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，具體如下：將2 g（0.002 8 mol）的化合物4加入到10 ml的四氫呋喃中，攪拌下加入0.15 g（0.002 3 mol）鋅粉、0.15 g（0.001 9 mol）乙酸銨和1.4 g（0.008 1 mol）N-異丁基哌啶酮，室溫下攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢，加入125 ml水和150 ml二氯甲烷，萃取。有機(jī)層再用25 ml 2%碳酸氫鈉溶液洗滌，有機(jī)層無(wú)水硫酸鈉干燥，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至干，70 ml石油醚結(jié)晶，干燥得到利福布汀1.04 g[收率：43.6%，HPLC法檢測(cè)純度：98.91%，mp＞250 ℃（分解）]，所得化合物收率和文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

2.7 N-異丁基哌啶酮的制備

將29.80 g（0.407 4 mol）異丁胺加入64 ml乙醇中，冷卻至10 ℃左右，滴加103.40 g（1.032 8 mol）丙烯酸乙酯，于20～25 ℃放置20 d（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全），減壓濃縮除去溶劑，殘余物溶于80 ml二甲苯中用于下一步反應(yīng)。將8.90 g（0.384 0 mol）鈉加入310 ml二甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至110 ℃，緩慢滴加上步所得二甲苯溶液，滴畢，回流3 h。冰浴冷卻，反應(yīng)液用水100 ml×2萃取，合并水相。于水相中加入96 ml濃鹽酸，加熱回流7 h，再用40%氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8。分別用240、160 ml二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷層，干燥，減壓除去溶劑，殘余物減壓蒸餾得到N-異丁基哌啶酮52.40 g。收率：85.2%，氣相色譜法檢測(cè)純度：98.5%，文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道收率：54.4%。

同時(shí)，筆者按照文獻(xiàn)[9-10]的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，將4-哌啶酮鹽酸鹽3.07 g（0.02 mol）、異丁基溴3.01 g（0.022 mol）和碳酸鉀7.52 g（0.04 mol）加入到50 ml乙腈中，室溫?cái)嚢?4 h（TLC法檢測(cè)反應(yīng)完全）。反應(yīng)液減壓濃縮干，向殘留物中加入50 ml水，再用35 ml×3乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，殘余物減壓蒸餾得到N-異丁基哌啶酮1.65 g。收率：52.6%，氣相色譜法檢測(cè)純度：98.41%，所得化合物收率與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

3 改進(jìn)

3.1 化合物3反應(yīng)溶劑的前處理

在重復(fù)文獻(xiàn)工藝制備利福布汀時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)化合物3的質(zhì)量直接影響終產(chǎn)物利福布汀的純度，可使其產(chǎn)生超過(guò)1%的單一最大雜質(zhì)。故本文設(shè)計(jì)將化合物3的反應(yīng)溶劑二氯甲烷進(jìn)行了前處理，在其他反應(yīng)條件不變的情況下，再監(jiān)測(cè)不同前處理方法對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)二氯甲烷未進(jìn)行任何處理的情況下，最終制得的利福布汀含量低、雜質(zhì)多；而將二氯甲烷分別進(jìn)行常壓蒸餾、氫化鈣干燥、分子篩干燥和氫氧化鉀干燥處理后，所得利福布汀含量均在99%左右，單一最大雜質(zhì)由1%以上降低到0.3%以下，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3-氨基利福霉素S的反應(yīng)溶劑二氯甲烷前處理方法對(duì)利福布汀含量和雜質(zhì)的影響（%）Tab 1 Effects of pretreatment method of dichloromethane as synthesis solvent of 3-amino-4-imino rifamycin S on the content and impurity of rifabutin（%）

由表1可見(jiàn)，化合物3的反應(yīng)體系應(yīng)無(wú)水，所以用于此步反應(yīng)的溶劑應(yīng)進(jìn)行脫水處理。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)和成本因素，選擇用固體氫氧化鉀作干燥劑進(jìn)行二氯甲烷的前處理。

3.2 合成化合物4的反應(yīng)溫度

在制備化合物4時(shí)，通過(guò)將反應(yīng)溫度控制在25～30、20～25、15～20、10～15 ℃，監(jiān)測(cè)反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)和雜質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度在20 ℃以上時(shí)，從TLC板上可以看出原料反應(yīng)完全，但是雜質(zhì)明顯隨溫度升高而增加；在15～20 ℃時(shí)，反應(yīng)完全，而且在TLC法檢測(cè)未見(jiàn)雜質(zhì)；在15 ℃以下時(shí)，反應(yīng)24 h發(fā)現(xiàn)原料明顯未反應(yīng)完全，即使延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，仍反應(yīng)不完全，但雜質(zhì)開(kāi)始明顯增加。由此可見(jiàn)，將反應(yīng)溫度控制在15～20 ℃、反應(yīng)24 h的條件最佳，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 側(cè)鏈N-異丁基哌啶酮的制備工藝

在化合物4制備成利福布汀時(shí)，本文對(duì)文獻(xiàn)[8]的工藝進(jìn)行改進(jìn)，使得產(chǎn)品收率由44.2%提高到60.94%。而在側(cè)鏈N-異丁基哌啶酮的合成中，文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的路線是通過(guò)4-哌啶酮鹽酸鹽和溴代烷經(jīng)取代反應(yīng)得到，雖然原料4-哌啶酮鹽酸鹽簡(jiǎn)單易得，但反應(yīng)收率僅有54.4%。本文側(cè)鏈工藝采用異丁胺和丙烯酸乙酯為起始原料，反應(yīng)條件較文獻(xiàn)報(bào)道的溫和簡(jiǎn)單，收率為85.2%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道。且本文所用原料異丁胺和丙烯酸乙酯較文獻(xiàn)中的主要原料便宜，可使側(cè)鏈的工業(yè)化生產(chǎn)成本控制在100元/kg以下。所以從原料成本和收率比較，本文工藝明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道工藝。

表2 反應(yīng)溫度對(duì)3-氨基-4-亞氨基利福霉素S合成含量的影響Tab 2 Effects of reaction temperature on the content of 3-amino-4-imino rifamycin S

4 討論

綜上所述，本文以利福霉素S為起始原料，經(jīng)溴代、硝基化、還原、亞氨基化，最后與側(cè)鏈環(huán)合得到利福布汀，總收率為16.44%。而且發(fā)現(xiàn)了為控制雜質(zhì)需在制備化合物1時(shí)對(duì)溶劑進(jìn)行無(wú)水處理這一關(guān)鍵技術(shù)，并確定了制備化合物4的最佳反應(yīng)溫度為15～20 ℃，在大大提高產(chǎn)品收率的同時(shí)，降低了反應(yīng)過(guò)程中雜質(zhì)的產(chǎn)生。側(cè)鏈N-異丁基哌啶酮的合成收率也明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道。故本文中利福布汀的改進(jìn)工藝原料易得、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、收率高、成本低，適合規(guī)模化生產(chǎn)；所得產(chǎn)品純度在99%以上，可達(dá)藥用要求。

[1]謝惠安，陽(yáng)國(guó)太，林善祥，等.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：510-544.

[2]鐘靜，黃平，麥潔兒.新型抗結(jié)核病藥物[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5（2）：399.

[3]于守汎.利福布汀的藥效學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2000，21（6）：262.

[4]刁琳鑒.利福布汀用于耐多藥肺結(jié)核病臨床效果觀察[J].醫(yī)學(xué)信息：中旬刊，2011（5）：1 968.

[5]Egidio M，Lauretta M.Process for the preparation of rifamycin s derivatives：GB，009744[P].1979-06-20.

[6]Leonardo M，Vittorio R，Carmine P.Rifamycin compounds：US，4017481[P].1977-04-12.

[7]Glabski T，Zukowski E，Szypka Z，et al.Preparation of spiropiperidyl rifamycin antibiotics：PL，168053[P].1995-12-30.

[8]Shin YC，Wang KJ.Process for preparing rifamycin derivatives：KR，137810[P].1998-02-12.

[9]Iwakubo M，Takami A，Okada Y，et al.Design and synthesis of rho kinaseinhibitors：Ⅲ[J].Bioorg Med Chem，2007，15（2）：1 022.

[10]Yoo KH，Choi HS，Kim DC，et al.Synthesis of heteroaryl piperazines and heteroaryl bipiperidines with a restricted side chain and their affinities for 5-HT1Areceptor[J].Arch Pharm：Weinheim，2003，336（4/5）：208.