正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選去甲斑蝥素在大鼠肝細(xì)胞中代謝的影響因素Δ

王曉輝，高 萍，李光遠(yuǎn)，王 瑛，陶遵威，李毅敏（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是斑蝥素的衍生物。與斑蝥素相比，其對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激性顯著降低，并具有獨(dú)特的升高白細(xì)胞總數(shù)的作用，也是我國(guó)首先合成的新型抗腫瘤藥物[1]。其衍生物眾多而且很多衍生物都表現(xiàn)出抗腫瘤活性[2]，其新型制劑研發(fā)工作也取得一些進(jìn)展[3]。但由于NCTD 自身化學(xué)性質(zhì)活潑、代謝快速以及代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性，導(dǎo)致其代謝機(jī)制和代謝物的深入研究非常困難，限制了NCTD開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

利用細(xì)胞株對(duì)藥物進(jìn)行代謝的研究方法可以排除體內(nèi)因素的干擾，為整體藥物研發(fā)提供可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)體內(nèi)代謝率低、毒性大以及缺少靈敏檢測(cè)方法的藥物來(lái)說(shuō)，細(xì)胞代謝法更是首選的研究方法。由于細(xì)胞對(duì)藥物的代謝受到細(xì)胞接種密度、給藥濃度等多種因素影響，所以本文設(shè)計(jì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究NCTD 在大鼠肝細(xì)胞（Buffalo rat liver，BRL）中代謝的相關(guān)影響因素，以提高代謝效率、獲得最佳培養(yǎng)方案，為后續(xù)及相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

GC-17A 氣相色譜儀[中國(guó)（上海）島津有限公司]；Infinite M200酶標(biāo)儀[帝肯（上海）貿(mào)易有限公司]；Legend Micro17R高速離心機(jī)（美國(guó)Therme Electron Corportion公司，離心半徑：78 mm）；TMS-PH-3倒置顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

NCTD 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100414-200501，純度：100%）；NCTD原料藥（南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ130421A，純度：99%）；達(dá)爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12800-027）。

1.3 細(xì)胞

大鼠BRL細(xì)胞（國(guó)家科學(xué)院典型培養(yǎng)保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)NCTD對(duì)BRL細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）

參考相關(guān)資料[4]，將BRL 細(xì)胞按照25 000、50 000、75 000個(gè)/ml 3 種密度進(jìn)行接種，用培養(yǎng)液將NCTD 配成10.0、7.14、5.10、3.64、2.60、1.86、1.33、0.949、0.678、0.484 μg/ml 10 個(gè)質(zhì)量濃度，培養(yǎng)48 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，重復(fù)3次。結(jié)果3種細(xì)胞接種密度下的IC50分別為（6.04±0.22）、（5.82±0.31）、（6.07±0.18）μg/ml，其平均值5.98 μg/ml即為NCTD對(duì)BRL細(xì)胞的IC50。

2.2 檢測(cè)NCTD相對(duì)含量的方法

2.2.1 色譜條件。色譜柱：DM-1 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；流動(dòng)相：氮?dú)?，流速? ml/min；檢測(cè)器：氫離子火焰檢測(cè)器（FID）；柱溫：200 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；無(wú)分流；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2.2 樣品的處理。收集各組培養(yǎng)液，加入10%三氯乙酸[10%三氯乙酸：培養(yǎng)液（0.6 ∶1）]除蛋白，以10 000 r/min離心5 min，取上清液濃縮干燥，將固體干燥物用200 μl水定容，靜置30 min充分溶解，取上清液濾過(guò)作為待測(cè)樣品。

2.2.3 方法專屬性考察。分別將NCTD對(duì)照品、空白培養(yǎng)液、培養(yǎng)液+NCTD對(duì)照品，經(jīng)“2.2.2”項(xiàng)下處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄色譜。結(jié)果空白培養(yǎng)液對(duì)NCTD 色譜峰幾乎無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氣相色譜圖A.對(duì)照品；B.空白培養(yǎng)液；C.培養(yǎng)液+NCTD對(duì)照品；1.NCTDFig 1 GC chromatogramsA.substance control；B.blank culture medium；C.culture medium sample+NCTD control；1.NCTD

2.2.4 精密度試驗(yàn)。配制質(zhì)量濃度分別為0.200 0、0.800 0、3.200 μg/ml 的NCTD 培養(yǎng)液樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣。同日內(nèi)測(cè)定5次，得日內(nèi)RSD為（2.58±0.37）%；每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，得日間RSD為（5.10±0.55）%。

2.2.5 檢測(cè)限考察。以信噪比為3 時(shí)，NCTD 的檢測(cè)限為10 ng/ml。

2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選最優(yōu)培養(yǎng)條件

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法與結(jié)果，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，選取細(xì)胞接種密度（A）、給藥濃度（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）為考察因素。因素A、C 的考察水平參考文獻(xiàn)選取3 個(gè)水平；因素B 考察水平以NCTD 對(duì)BRL 細(xì)胞的IC50為參考，選取3 個(gè)水平，具體數(shù)值見(jiàn)表1。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal test

按照4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)體系置于37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，以培養(yǎng)體系中NCTD的相對(duì)含量的峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與極差分析（n＝3）Tab 2 Results of orthogonal test and analysis of range（n＝3）

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方差分析Tab 3 Results of orthogonal test and analysis of variance

由表2、表3可知，各因素對(duì)培養(yǎng)體系中NCTD相對(duì)含量的影響順序?yàn)锳＞B＞C。其中，因素A 有顯著性影響（P＜0.05），選擇水平3；而因素B、因素C 各水平間差異不大，從培養(yǎng)效率方面考慮，均選擇水平2。故最優(yōu)培養(yǎng)條件為A3B2C2，即接種密度為75 000個(gè)/ml，給藥濃度為6 g/ml，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。根據(jù)最優(yōu)條件培養(yǎng)，試驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)其體系中NCTD的相對(duì)含量的峰面積為10 567±664。

3 討論

有資料報(bào)道NCTD 對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402、HL-7702 的IC50分別為18.84、22.66 μg/ml[7]，對(duì)海拉癌細(xì)胞Hela 的IC50為261 μg/ml[8]，對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的IC50為7.85 μg/ml[9]。本研 究 中NCTD 對(duì)BRL 細(xì) 胞 的IC50為5.98 μ g/ml，由 此 表 明NCTD對(duì)不同細(xì)胞株的抑制率是不一樣的，所以在對(duì)不同細(xì)胞株試驗(yàn)研究時(shí)，應(yīng)該對(duì)其抑制率進(jìn)行研究。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，筆者將NCTD對(duì)BRL細(xì)胞IC50的0.5、1、2倍作為正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的給藥濃度，即3、6、12 μg/ml。

由于NCTD分子結(jié)構(gòu)中不含共軛結(jié)構(gòu)，無(wú)強(qiáng)生色團(tuán)，導(dǎo)致NCTD 無(wú)紫外特征吸收峰，所以使用紫外檢測(cè)法進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究和體外代謝產(chǎn)物研究時(shí)會(huì)受較多干擾，達(dá)不到檢測(cè)要求。本試驗(yàn)建立氣相色譜法測(cè)定培養(yǎng)基中NCTD 藥物濃度，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察研究。結(jié)果表明，該方法符合生物樣品的分析要求，可為NCTD的體內(nèi)外藥動(dòng)學(xué)研究、臨床給藥監(jiān)測(cè)以及開(kāi)發(fā)高效低毒的NCTD衍生物和新劑型等提供簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)方法。體外代謝是利用各種體外代謝模型對(duì)候選化合物進(jìn)行高通量篩選，可以對(duì)代謝過(guò)快或生成毒性代謝物的候選化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改良，也可以通過(guò)模擬或合成活性代謝物的結(jié)構(gòu)得到新的候選化合物。與體內(nèi)代謝研究相比，體外代謝研究可在新藥研發(fā)早期利用候選化合物的體外代謝參數(shù)合理預(yù)測(cè)候選化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，指導(dǎo)后期藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)以及安全性評(píng)價(jià)的模型選擇，縮小體內(nèi)研究的篩選范圍，具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種密度對(duì)以代謝快慢具有顯著的影響且影響最大；而給藥濃度和培養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有顯著性，通過(guò)直觀分析看到給藥濃度的影響次之，培養(yǎng)時(shí)間影響最小。當(dāng)接種密度為75 000個(gè)/ml、給藥濃度為6 g/ml、培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，在培養(yǎng)液中剩余NCTD含量是最低的，說(shuō)明在此條件下，NCTD 在BRL 細(xì)胞中代謝效率最高。NCTD 在BRL 細(xì)胞中代謝最優(yōu)培養(yǎng)條件的研究結(jié)果可為NCTD體外代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究提供可靠的科學(xué)數(shù)據(jù)和必要的前提條件。

[1]余濤，劉曼曼，侯風(fēng)剛，等.去甲斑蝥素抗腫瘤分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（4）：73.

[2]李賀敏，彭國(guó)平，陳農(nóng)，等.新型斑蝥素羧酸衍生物的合成及其抗癌活性[J].合成化學(xué)，2013，21（5）：518.

[3]牛硯濤，武冬雪，董文娜，等.去甲斑蝥素新型制劑研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（9）：663.

[4]魏偉，吳希美，李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1 568-1 569.

[5]楊慈清，李小英.Hepal-6細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15 507.

[6]王爽，梁偉伶，劉斯斯，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選HepG2 細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（13）：1 603.

[7]胡瑋，章良，王欽，等.去甲斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒的肝靶向抗腫瘤藥效學(xué)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志，2010，19（19）：1 814.

[8]劉洪月，楊紅，吳秀鳳，等.葉酸修飾去甲斑蝥素隱形泡囊的制備、表征及體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志，2013，22（18）：2 174.

[9]王晨宇，李猛，王天陽(yáng)，等.DHA 聯(lián)合去甲斑蝥素對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖及凋亡的影響[J].世界華人消化雜志，2013，21（11）：1 008.

[10]吳慧，彭英，孫建國(guó)，等.體外代謝在新藥早期評(píng)價(jià)中的應(yīng)用與發(fā)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（7）：1 071.