蒙藥肝樂康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

包明蘭，巴根那，白梅榮，薩日古樂（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 08000）

蒙藥肝樂康膠囊是在傳統(tǒng)驗(yàn)方地格達(dá)-4味湯基礎(chǔ)上研制的復(fù)方制劑，由肋柱花、苦參、梔子、瞿麥等4味藥組成，具有清“協(xié)日”、涼血、清糟歸精、除“粘熱”等功效，主要用于血熱相搏、肝膽熱、咽喉腫痛、口渴等證[1]。為有效控制其制劑質(zhì)量，筆者采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中的肋柱花、苦參、梔子進(jìn)行了定性鑒別；并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)苦參的主要成分苦參堿與氧化苦參堿進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括Openlab色譜工作站、G1315D檢測(cè)器（美國Agilent公司）；ISO9001型電子天平（上海藍(lán)習(xí)實(shí)業(yè)有限公司）；ZF-I型紫外燈（上海雙旭電子有限公司）；HHS21-4型電子恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械）；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

肝樂康膠囊（烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)：20120604、20120605、20120606）；獐牙菜苦苷對(duì)照品（批號(hào)：0785-200203）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-200613）、苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：0805-9703）、氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：0780-200004）均由中國食品藥品檢定研究院提供；硅膠G（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 肋柱花的TLC鑒別[2]取本品內(nèi)容物1.0 g，加25 ml甲醇，超聲（功率：50 W，頻率：45 kHz）處理50 min，濾過，濾液濃縮成1 ml，作為供試品溶液；另取缺肋柱花的陰性樣品0.75 g，同法制成陰性對(duì)照溶液；精密稱取獐牙菜苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品溶液。照TLC法（2010年版《中國藥典》）[3]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（17 ∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。肋柱花的TLC圖見圖1。

2.1.2 苦參的TLC鑒別[3-4]取本品內(nèi)容物1.0 g，加10 ml三氯甲烷和0.2 ml濃氨試液，室溫浸泡12 h，濾過，取濾液作為供試品溶液；另取缺苦參的陰性樣品0.75 g，同法制成陰性對(duì)照溶液；精密稱取苦參堿對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml的對(duì)照品溶液。照TLC法（2010年版《中國藥典》）[3]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各6μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀氫氧化鉀試液，于110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。苦參的TLC圖見圖2。

圖1 肋柱花的TLC圖1.獐牙菜苦苷對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 1 TLC oflomatogonium.rotatum1.swertiamain control；2-4.test samples；5.negative control

圖2 苦參的TLC圖1.苦參堿對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 2 TLC ofSophora.flavescens1.matrine control；2-4.test samples；5.negative control

2.1.3 梔子的TLC鑒別[5-7]取本品內(nèi)容物1.0 g，加50%甲醇10 ml，超聲（功率：50 W，頻率：45 kHz）處理40 min，濾過，取濾液作為供試品溶液；另取缺梔子的陰性樣品0.75 g，同法制成陰性對(duì)照溶液；精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為1.5 mg/ml的對(duì)照品溶液。照TLC法（2010年版《中國藥典》）[3]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。梔子的TLC圖見圖3。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：lnertsil NH2Columns C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-3%磷酸水-無水乙醇（80 ∶10 ∶10，V/V/V）；流速：0.1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：220 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備[3]分別精密稱取苦參堿對(duì)照品2.0 mg、氧化苦參堿對(duì)照品3.75 mg，加乙腈-無水乙醇（80 ∶20，V/V）制成苦參堿氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備[8-13]稱取肝樂康膠囊內(nèi)容物約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加0.5 ml濃氨試液和20 ml三氯甲烷，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：50 W，頻率：45 kHz）處理30 min，放冷，再次精密稱定，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 ml，加于中性氧化鋁柱（內(nèi)徑1 cm）上，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇溶液（70 ∶30，V/V）各20 ml洗脫，合并洗脫液，回收溶劑，殘?jiān)訜o水乙醇定容至10 ml，搖勻，即得。

圖3 梔子的TLC圖1.梔子苷對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 3 TLC ofGardenia.jasminoides1.jasminoidin control；2-4.test samples；5.negative control

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 精密稱取缺苦參的陰性對(duì)照品0.75 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.2.5 空白干擾試驗(yàn) 精密量取上述對(duì)照品、陰性對(duì)照和供試品溶液各10 μl，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，繪制HPLC圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)苦參堿和氧化苦參堿的測(cè)定無干擾。色譜見圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.供試品；B.對(duì)照品；C.陰性對(duì)照；1.苦參堿；2.氧化苦參堿Fig 4 HPLC chromatogramsA.test sample；B.substance control；C.negative control；1.matrine；2.oxymatrine

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得苦參堿的回歸方程為y＝30 975x－1 543.1（r＝0.999 8）、氧化苦參堿的回歸方程為y＝55 915x－4 977.1（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，苦參堿和氧化苦參堿的進(jìn)樣量分別在0.2～1.2和0.3～1.8 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿和氧化苦參堿的峰面積RSD分別為1.72%、0.35%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、36、48 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，苦參堿和氧化苦參堿的峰面積RSD分別為0.32%、0.26%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.59%、1.14%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品6份，分別精密加入適量的苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，并以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，3批樣品（20120604、20120605、20120606）中苦參堿的平均含量分別為13.79、13.78、13.76 mg/g，氧化苦參堿的平均含量分別為6.57、6.56、6.59 mg/g。

3 討論

研究表明，肝樂康膠囊具有抗乙型肝炎病毒的作用[14]，其中苦參為其重要藥效成分[15]，苦參提取物苦參堿和氧化苦參堿具有明顯的抗乙型肝炎的作用，有效率可達(dá)55%[16]。為此，本試驗(yàn)除采用TLC法對(duì)方中的肋柱花、苦參和梔子進(jìn)行定性鑒別外，還運(yùn)用HPLC法對(duì)苦參的有效成分苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)行了含量測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果較理想，可為制訂含苦參制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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