不同指標評價布渣葉藥材質(zhì)量的聚類分析Δ

李澤華，徐文杰，董玉娟，汪夢霞，許燦新（1.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學科學院，廣州 510080；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095；.廣州中醫(yī)藥大學附屬第二中醫(yī)院，廣州 510405）

布渣葉為椴樹科植物破布葉Microcos paniculataL.的干燥葉，主產(chǎn)于我國嶺南地區(qū)，屬于廣東道地藥材。其味微酸、性平，具有消食化滯、清熱利濕的功效，臨床多用于飲食積滯、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸等癥，已收載于2010年版《中國藥典》（一部）和《廣東省中藥材標準》（第一冊）[1-2]。布渣葉含有黃酮類、生物堿、三萜類、揮發(fā)油類等成分[3]，其中黃酮類是其主要活性成分[4]。關于不同產(chǎn)地的布渣葉中總黃酮及牡荊苷質(zhì)量分數(shù)的分析已有相關報道[5-10]，但未見應用聚類分析法從總黃酮及牡荊苷質(zhì)量分數(shù)兩個指標來對不同產(chǎn)地布渣葉進行質(zhì)量評價的研究報道。筆者選擇不同產(chǎn)地的布渣葉，分別以總黃酮與牡荊苷的含量為指標，并應用聚類分析法對布渣葉進行產(chǎn)區(qū)分類，以為完善布渣葉的藥材質(zhì)量評價標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀，配備PAD檢測器、四元梯度泵、Empower 2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國沃特斯公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mettler XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；MilliPore Advantage A10自動純水機（美國默克密理博公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（批號：100080-200707）、牡荊苷對照品（批號：111687-200602）均購于中國食品藥品檢定研究院；D101型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

布渣葉經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦教授鑒定為椴樹科植物破布葉M.paniculataL.的干燥葉，藥材來源見表1。

表1 布渣葉藥材來源Tab 1 Source ofM.paniculata

2 方法與結(jié)果

2.1 牡荊苷的含量測定[1]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：AKKZONOBEL Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%甲酸溶液（30 ∶70，V/V）；檢測波長：339 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃。色譜見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 取牡荊苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 ml含牡荊苷106.70μg的對照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取布渣葉藥材粉末（過3號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理1 h，放冷，再次精密稱定，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.樣品；B.對照品；1.牡荊苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.sample；B.control substance；1.vitexin

2.1.4 線性關系考察 精密量取“2.1.2”項下的對照品溶液1、2、6、9、12、15 ml，分別置25 ml量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，制成每1 ml含牡荊苷4.27、8.54、25.62、38.43、51.24、64.05μg的對照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，進樣量（x，ng）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝2 338.3x+8 595（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，牡荊苷的進樣量在42.70～640.50 ng范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取牡荊苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為106.70 μg/ml）10 μl，按上述色譜條件進樣測定，重復5次，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝1.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（S1）溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，RSD＝1.35%（n＝7），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（S1）6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算樣品含量。結(jié)果，牡荊苷的平均質(zhì)量分數(shù)為0.11%，RSD＝1.16%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分數(shù)的樣品（S1）約1.0 g，共9份，精密稱定，分別精密加入適量的牡荊苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.9 樣品中牡荊苷的含量測定 取布渣葉藥材適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算樣品中牡荊苷的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加70%乙醇超聲（功率：250 W，頻率：100 kHz）使溶解，制成每1 ml含0.46 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各批次布渣葉藥材粉末（過3號篩）約2.0 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：100 kHz）處理30 min，放冷，再次精密稱定，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，95 ℃水浴加熱，蒸干，加水5 ml使溶解，過D101型大孔吸附樹脂柱，以水100 ml洗脫，棄去水液，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

表2 牡荊苷加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品中牡荊苷的含量測定結(jié)果（n＝2）Tab 3 Content determination of vitexin in samples（n＝2）

2.2.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置25 ml量瓶中，加70%乙醇至6 ml，依次精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml（搖勻，放置6 min）、10%硝酸鋁溶液1 ml（搖勻，放置6 min）、氫氧化鈉試液10 ml，加水至刻度（搖勻，放置15 min），以相應試劑為空白，在500 nm波長處測定吸光度（A）。以A（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.008 8x+0.064 2（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，蘆丁的質(zhì)量濃度在18.28～109.68 μg/ml范圍內(nèi)與其吸光度呈良好線性關系。

2.2.4 樣品中總黃酮的含量測定 取上述布渣葉藥材，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，結(jié)果見表4。

表4 樣品中總黃酮的含量測定結(jié)果（n＝2）Tab 4 Content determination of total flavonoids in samples（n＝2）

2.3 聚類分析

應用SAS JMP Statistical Discovery V9.0.2.0統(tǒng)計分析大師軟件，采用離差平方和法，選取歐氏距離平方和作為樣品的測度，對20份布渣葉樣品的牡荊苷和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)分別進行聚類分析。樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類分析樹狀圖見圖2；樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類歷史記錄見表5、表6。

圖2 樣品中牡荊苷、總黃酮含量的聚類分析樹狀圖A.牡荊苷含量；B.總黃酮含量Fig 2 Cluster analvsts of the content of vitexin and total flavonoids in samplesA.vitexin；B.total flavonoids

以牡荊苷的質(zhì)量分數(shù)為指標，當歐氏距離為0.75時，所有樣品分為四大類，其中1、11、12聚為一類，3、5、13、14、16、19聚為一類，7、10、17、18聚為一類，2、4、6、8、9、15、20聚為一類。以總黃酮的質(zhì)量分數(shù)為指標，當歐氏距離為0.72時，所有樣品分為四大類，其中1、5、15、16、17、20聚為一類，2、6、9、10、18聚為一類，11為一類，3、4、7、8、12、13、14、19聚為一類。結(jié)果表明，同一產(chǎn)區(qū)的布渣葉并沒有全部歸為一類，這可能與布渣葉藥材具體的采收地點、采收時間、干燥方法、貯藏方法不同等有關，也說明布渣葉對地理環(huán)境、采收時間和加工貯藏方法等因素比較敏感。

采用SPSS Statistic 17.0統(tǒng)計軟件對布渣葉中牡荊苷與總黃酮質(zhì)量分數(shù)的相關性進行分析。結(jié)果表明，二者沒有顯著性關系，相關性數(shù)據(jù)見表7。

表5 樣品中牡荊苷含量的聚類歷史記錄Tab 5 Cluster record of the content of vitexin in samples

表6 樣品中總黃酮含量的聚類歷史記錄Tab 6 Cluster record of the content of total flavonoids in samples

3 討論

在總黃酮質(zhì)量分數(shù)測定中，筆者分別以供試品、對照品及空白對照在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，對照品溶液及供試品溶液的最大吸收波長一致，兩者在（500±2）nm處有最大吸收，故選擇500 nm為測定波長。

本研究分別以牡荊苷和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)為指標進行聚類分析，二者結(jié)果不相同，進一步對樣品中牡荊苷和總黃酮質(zhì)量分數(shù)的相關性進行研究，二者仍無相關性，即牡荊苷質(zhì)量分數(shù)的高低并不能代表樣品中總黃酮的高低，這同時也表明，以單一活性成分判斷藥材質(zhì)量的優(yōu)劣是有缺陷的。本研究結(jié)果表明布渣葉藥材的質(zhì)量受到諸多因素的影響，且評價布渣葉藥材質(zhì)量時應進行多指標的綜合評價。

表7 樣品中牡荊苷與總黃酮含量的相關性分析Tab 7 Relative data of the contents of vitexin and total flavonoids in samples

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