正交試驗優(yōu)選消疹止癢膠囊藥材的提取工藝

張 勇，紅 梅，錫林通嘎拉嘎，孟 竹，羅 璇（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)處，呼和浩特 010010）

消疹止癢膠囊是在我院名老中醫(yī)傳統(tǒng)方劑的基礎(chǔ)上研制而成的純中藥制劑，廣泛用于血虛風熱所致的各種皮膚疾病，尤其對于急、慢性蕁麻疹的療效較好[1-2]。該方由川芎、生地、桑白皮、地骨皮、白鮮皮、麻黃、蟬蛻、訶子等中藥組成，具有養(yǎng)血疏風、清熱止癢之功效，原以煎劑應(yīng)用于臨床達40余年，療效甚佳，深受廣大患者認可。但是由于劑型的限制，使用上有諸多不便，故研制成膠囊。方中川芎有效成分阿魏酸微溶于水，可溶于熱水，水溶液中穩(wěn)定性差，見光易分解，易溶于乙醇、甲醇、丙酮，難溶于苯、石油醚[3-4]；訶子中含有大量鞣質(zhì)，其主要成分為訶子酸、沒食子酸等；沒食子酸易溶于水、乙醇等，幾乎不溶于苯、氯仿與石油醚[5]。為發(fā)揮其最大臨床療效，本研究根據(jù)藥物有效成分的性質(zhì)和藥理作用，經(jīng)過多次試驗和查閱有關(guān)文獻[6-10]，確定以阿魏酸、沒食子酸的含量為指標，采用正交試驗法對提取工藝進行系統(tǒng)考察，選出消疹止癢膠囊最優(yōu)提取工藝。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT VP型高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp泵、SCL-10Avp型控制器、SPA-10Avp型檢測器、CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；J6MC型高速離心機（美國Beck-Man公司）。

1.2 藥材

川芎、生地、桑白皮、地骨皮、白鮮皮、麻黃、蟬蛻、訶子均購自內(nèi)蒙古醫(yī)藥有限責任公司，經(jīng)筆者鑒定為真品。

1.3 試劑

阿魏酸對照品（批號：0773-9910）、沒食子酸對照品（批號：0831-9501）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗優(yōu)選消疹止癢膠囊藥材醇提工藝

2.1.1 提取工藝 精密稱取樣品9份，每份樣品按處方量分別精密稱取川芎、桑白皮、地骨皮、麻黃、白鮮皮按L9（34）正交試驗表進行乙醇提取，減壓回收乙醇至半稠膏，加入處方量一半的蟬蛻細粉，混勻，干燥，粉碎至粉末，備用。取本品0.5 g，研細，精密稱定，加20 ml 0.5%碳酸鈉溶液，超聲處理30 min，離心，取上清置分液漏斗中，藥渣用0.5%碳酸鈉溶液洗滌3次，每次10 ml，離心，取上清并入分液漏斗中，用HCl調(diào)pH至1～2，用25、25、20、20、20 ml乙醚萃取5次，乙醚液蒸干，用30%甲醇溶液微熱使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 ml棕色量瓶中，并用30%甲醇定容，離心，取上清，得消疹止癢膠囊醇溶藥材溶液。

2.1.2 含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Phenomen kromasil C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-1%冰醋酸（30 ∶70，V/V）；檢測波長：316 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μl。理論板數(shù)按阿魏酸峰計不得低于3 000。（2）對照品溶液的制備。取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含10μg的阿魏酸對照品溶液，即得。（3）標準曲線的制備。精密稱取阿魏酸對照品2.5 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密吸取1、2、3、4、5、6 ml溶液，分別置10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻。按“2.1.2（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，藥物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝7 515 745.48x－735.49（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，阿魏酸質(zhì)量濃度在0.053 8～0.322 8 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 正交試驗優(yōu)選醇提工藝 根據(jù)文獻[11-12]及預(yù)試驗，以阿魏酸含量為評價指標，乙醇的體積分數(shù)（A）、乙醇的用量（B）、回流時間（C）、回流次數(shù)（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平（n＝3）Tab 1 Factors and levels（n＝3）

表2 正交試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of orthogonal test（n＝9）

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

由表2、表3中可知，各因素對試驗結(jié)果影響的大小順序為：C＞A＞D＞B；由方差分析結(jié)果可見，乙醇的體積分數(shù)（A）、乙醇的用量（B）、回流時間（C）、回流次數(shù)（D）對阿魏酸含量的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)試驗結(jié)果和實際生產(chǎn)情況，綜合各因素，選定最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D3，即8倍量90%的乙醇提取3次，每次1.5 h。

2.2 正交試驗優(yōu)選消疹止癢膠囊藥材水提工藝

2.2.1 提取工藝 精密稱取樣品9份，每份樣品按處方量分別精密稱取生地、訶子按L9（34）正交試驗表進行水提取，減壓濃縮至半稠膏，加入處方量一半的蟬蛻細粉，混勻，干燥，粉碎至粉末，備用。取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，搖勻，稱定質(zhì)量，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，水浴蒸干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，得消疹止癢膠囊水溶藥材溶液。

2.2.2 含量測定（1）色譜條件。色譜柱：Phenomen kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：2%甲醇的乙腈溶液-0.1%三乙胺、0.1%磷酸等比混合溶液（3 ∶97，V/V）；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μl。理論板數(shù)按沒食子酸峰計算應(yīng)不低于5 000。（2）對照品溶液的制備。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 ml含15μg的沒食子酸對照品溶液。（3）標準曲線的制備。精密稱取沒食子酸對照品0.374 mg，置25 ml棕色量瓶中，加流動相定容，搖勻，精密吸取1、2、4、6、8、10 ml溶液，按“2.2.2（1）”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以峰面積積分值（y）為縱坐標，藥物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝21 406.2x－120 506.5（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.014 96～0.149 6 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 正交試驗優(yōu)選水提工藝 根據(jù)預(yù)試驗[11-12]，以沒食子酸含量為評價指標，加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）、浸泡時間（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。因素水平見表4；正交試驗結(jié)果見表5；方差分析結(jié)果見表6。

表4 因素與水平（n＝3）Tab 4 Factors and levels（n＝3）

表5 正交試驗結(jié)果（n＝9）Tab 5 Results of orthogonal test（n＝9）

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Analysis of variance

從表5、表6中可以看出，各因素對試驗結(jié)果影響的大小順序為：A＞C＞D＞B：由方差分析結(jié)果可見，加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數(shù)（C）、浸泡時間（D）對沒食子酸含量的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)試驗結(jié)果和實際生產(chǎn)情況，綜合各因素，選定最優(yōu)提取工藝為A1B1C3D3，即8倍量水浸泡2 h后煎煮3次，每次1 h。

2.3 驗證試驗

按上述優(yōu)選的最優(yōu)工藝，制備3批消疹止癢膠囊（批號：20100916、20100917、20100918）樣品，對工藝進行驗證。依照該制劑質(zhì)量標準方法進行含量測定[13]，測得阿魏酸的含量分別為0.082 0、0.082 2、0.078 3 mg/g，RSD＝2.72%；沒食子酸的含量分別為2.814 0、2.796 0、2.809 0 mg/g，RSD＝0.93%。驗證結(jié)果表明，優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本試驗是綜合處方中藥物有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用及生產(chǎn)實踐等多方面的因素，經(jīng)多次試驗研究、分析比較而確定分別采用醇提和水提法[14]。川芎中主要含有揮發(fā)油、川芎嗪、阿魏酸、多糖等，桑白皮主要含有黃酮類衍生物、香豆類衍生物和三萜類化合物；地骨皮含有甜菜堿、β-谷甾醇、亞油酸、桂皮酸及多種酚性物質(zhì)等；白蘚皮、麻黃主要成分均為生物堿類，這些成分在醇中均有一定的溶解性，故采用醇提的方法提取。方中君藥川芎因其有效成分川芎嗪易升華，在工藝制備過程中損失較大，成品中轉(zhuǎn)移率較低，測定其含量無實際意義，故選擇阿魏酸為指標性成分，運用高效液相色譜法對制劑中川芎的阿魏酸進行含量測定，通過L9（34）正交試驗設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)選。

地黃為方中臣藥，主要含梓醇等環(huán)烯醚萜苷類化合物和多糖，具有清熱涼血、滋陰、提高人體免疫力等功效。地黃與訶子中的成分在水中具有一定溶解性，故采用水提法。但是，梓醇化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化分解，所以選擇以沒食子酸（訶子）的含量為評價指標，對水提取工藝條件進行優(yōu)選。

根據(jù)試驗結(jié)果及生產(chǎn)實際情況，乙醇提取物中以阿魏酸的含量為評價指標，全面考察了影響乙醇提取效率的因素；以沒食子酸含量為評價指標，考察了影響水提工藝主要因素。結(jié)果表明，優(yōu)選出的最佳工藝操作簡便、穩(wěn)定可行，有效成分得到很好的保留。

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