大劑量高壓氧超早期治療對(duì)局部腦梗死大鼠細(xì)胞凋亡的影響

于秋紅，李婕，劉亞玲，郁軍超，薛連璧

神經(jīng)保護(hù)是腦梗死的治療策略之一，也是腦血管病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。有研究提示高壓氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治療能促進(jìn)腦血管側(cè)支循環(huán)建立[1]，且有直接神經(jīng)保護(hù)作用，可保護(hù)缺血半暗帶休眠腦細(xì)胞[2]。我們前期實(shí)驗(yàn)[3]提示大劑量HBO超早期治療永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能在抑制、阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)其腦缺血后病理變化方面具有一定的作用，通過(guò)提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，減小腦梗死體積可能是其機(jī)制之一。有研究[4]顯示高壓氧可以通過(guò)抑制一氧化碳中毒大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低來(lái)影響細(xì)胞凋亡，但對(duì)腦梗死大鼠是否具有同樣作用，目前尚無(wú)研究?；诖?，我們采用HBO單次9 h方案治療超早期局部腦梗死大鼠，觀(guān)察HBO對(duì)細(xì)胞凋亡和膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，重量（280±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2 試劑 北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)水合氯醛、2，3，5苯四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）、蔗糖，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司出品多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，Cat#KGT549）、檸檬酸鈉（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）試劑盒（Cat#KGA7044，含緩沖液、熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶、抗熒光素抗體、辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺顯色劑）、細(xì)胞懸液制備試劑盒（Cat#KGA829）、羅丹明123染色試劑盒（Cat#KGA217）。

1.2 模型制作及分組 采用改良的Zea-longa線(xiàn)栓法[5]制作大鼠永久性MCAO模型，選擇阻塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，模型制作后3 h采用姿勢(shì)反射實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分（3分制）[6]，評(píng)分≥1分的動(dòng)物視為造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、無(wú)自主行動(dòng)大鼠和無(wú)神經(jīng)功能缺損大鼠，造模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=36）和HBO組（n=36）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用上海減壓器廠(chǎng)生產(chǎn)的透明純氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙。HBO組動(dòng)物于MCAO后3 h內(nèi)開(kāi)始HBO。治療壓力為0.2 MPa。升壓20 min，穩(wěn)壓9 h，減壓40 min。為避免氧中毒，大鼠分別于1 h、3 h、5 h、7 h、9 h呼吸純氧，2 h、4 h、6 h、8 h呼吸艙內(nèi)高壓空氣。對(duì)照組大鼠于MCAO后，呼吸常壓空氣。

1.4 觀(guān)察指標(biāo) ①神經(jīng)功能評(píng)分：采用Garcia評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]在MCAO后3 h、13 h、72 h對(duì)大鼠行為學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。②腦梗死體積：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，各時(shí)間點(diǎn)每組取6只大鼠，全腦于冷凍狀態(tài)下切成5片，每片冠狀切片厚度2 mm。對(duì)腦組織進(jìn)行TTC染色后測(cè)定各組腦梗死體積，正常腦組織染成粉紅或紫紅色，梗死灶染成白色。用ⅠmageJ軟件對(duì)每只大鼠腦組織梗死面積、半球面積進(jìn)行定量測(cè)定，為除去梗死部位組織水腫帶來(lái)的誤差，采用校正的梗死面積測(cè)定公式，即梗死面積=右側(cè)半球面積－（左側(cè)半球面積－測(cè)定的左側(cè)半球梗死面積）[8]。梗死容積=Σ（相鄰兩片腦組織梗死面積相加×1/2×層厚）。考慮到不同體重大鼠的腦組織的基線(xiàn)重量不同，所以計(jì)算相對(duì)梗死容積，即梗死容積占大腦總?cè)莘e的百分比[8]。③凋亡細(xì)胞數(shù)：于模型制成后13 h、72 h取材，每組取6只大鼠麻醉，生理鹽水、4%甲醛灌注，取前囟后3～6 mm處腦組織冷凍切片后行TUNEL染色，按TUNEL染色說(shuō)明書(shū)操作，將厚度為20 μm冷凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，置于濕盒中37℃反應(yīng)60 min，PBS沖洗3次后熒光顯微鏡觀(guān)察，各組均可見(jiàn)標(biāo)記為綠色熒光的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，各樣本隨機(jī)選取5個(gè)缺血半暗帶視野觀(guān)察，計(jì)數(shù)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。④線(xiàn)粒體膜電位：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，每組各時(shí)間點(diǎn)取6只大鼠，將缺血半暗帶腦組織[9]剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，經(jīng)過(guò)漂洗、吹打、研磨、過(guò)濾、離心制成細(xì)胞懸液，加入羅丹明123染液，按說(shuō)明書(shū)操作，孵育、離心、重懸細(xì)胞培養(yǎng)、離心、再重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)羅丹明123熒光強(qiáng)度以觀(guān)察膜電位變化情況，激發(fā)波長(zhǎng)488～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～575 nm。熒光值越高，表示線(xiàn)粒體跨膜電位越低，反映線(xiàn)粒體功能越差，正常值為1067.96。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以s表示，同組間不同時(shí)間點(diǎn)比較采用相關(guān)樣本t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

對(duì)照組大鼠死亡7只，13 h內(nèi)2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h內(nèi)分別死亡1只、2只和2只，經(jīng)解剖證實(shí)死因分別為腦出血、腦水腫和蛛網(wǎng)膜下腔出血，剔除數(shù)據(jù)后重新補(bǔ)充模型。HBO組治療過(guò)程中無(wú)死亡、癲癇發(fā)生。

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 兩組各時(shí)間點(diǎn)Garcia評(píng)分比較見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與3 h相比，各組大鼠在MCAO 13 h時(shí)神經(jīng)功能較MCAO 3 h時(shí)即有明顯改善（P均=0.007），72 h時(shí)改善有更明顯的趨勢(shì)（P均＜0.001），但72 h時(shí)與13 h時(shí)比無(wú)顯著差異。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與HBO組相比，神經(jīng)功能無(wú)顯著差異。

2.2 腦梗死容積 可以觀(guān)察到梗死灶主要位于左側(cè)MCA分布區(qū)的皮層、皮層下白質(zhì)和基底節(jié)區(qū)。各組腦梗死容積比符合正態(tài)分布，對(duì)照組13 h、72 h時(shí)梗死容積百分比分別為（15±5.2）%、（28±5.3）%，HBO組大鼠13 h、72 h時(shí)梗死容積比分別為（11±3.0）%、（15±7.3）%，缺血13 h時(shí)兩組大鼠腦梗死容積比無(wú)顯著差異，72 h時(shí)對(duì)照組腦梗死容積比較13 h時(shí)增大（P=0.02），HBO組腦梗死容積比較對(duì)照組小，差異有顯著性（P=0.02）。

2.3 凋亡細(xì)胞數(shù) 缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，13 h時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)HBO組較對(duì)照組少，差異有顯著性（P=0.04），72 h時(shí)兩組的凋亡細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P=0.92）。對(duì)照組72 h時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)少于13 h時(shí)，差異有顯著性（P=0.03），HBO組72 h時(shí)與13 h時(shí)無(wú)顯著差異（P=0.47），詳見(jiàn)表2。

2.4 線(xiàn)粒體膜電位 從MCAO后13 h開(kāi)始，對(duì)照組熒光值升高，提示線(xiàn)粒體膜電位下降，至72 h無(wú)明顯變化（P=0.76）。HBO組熒光值相對(duì)穩(wěn)定于較低水平，提示線(xiàn)粒體膜電位穩(wěn)定于較高水平，72 h與13 h比，無(wú)顯著差異（P=0.58）。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)膜電位均低于HBO組（P＜0.001）（表3）。

表1 各組大鼠Garcia評(píng)分比較

3 討論

目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示HBO治療永久性腦動(dòng)脈阻塞模型結(jié)論存在爭(zhēng)議，HBO時(shí)間窗和劑量是療效差異的關(guān)鍵。有文獻(xiàn)表明，幕上非腔隙性梗死的病理演變時(shí)間是6～18 h，平均約10 h[10]。基于上述理論，我們采用9 h HBO在3 h內(nèi)開(kāi)始治療永久性MCAO大鼠，力求阻止，甚至逆轉(zhuǎn)卒中的病理演變過(guò)程。本研究和前期結(jié)果[3，11]類(lèi)似，顯示了單次9 h HBO能改善局部腦梗死大鼠神經(jīng)功能，縮小腦梗死容積。缺血周?chē)鷧^(qū)存在部分休眠細(xì)胞，及時(shí)供氧可能挽救其功能，反之，則發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是個(gè)主動(dòng)耗能過(guò)程，需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供能，ATP的缺乏將直接阻斷凋亡通路，使細(xì)胞轉(zhuǎn)向壞死[12-13]，進(jìn)而擴(kuò)大梗死容積。ATP的主要來(lái)源是線(xiàn)粒體，從理論上講，如果能促進(jìn)線(xiàn)粒體產(chǎn)生ATP，則可減少細(xì)胞壞死，縮小梗死容積。線(xiàn)粒體膜電位是線(xiàn)粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的先決條件，膜電位下降，標(biāo)志著細(xì)胞不可逆損傷的開(kāi)始[14]。李強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)缺血后腦組織線(xiàn)粒體存在短暫的內(nèi)源性代償修復(fù)機(jī)制，但不足以逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)線(xiàn)粒體的持續(xù)損傷。Li等[13]應(yīng)用培養(yǎng)的海馬細(xì)胞證實(shí)減少氧自由基聚集，可以抑制膜電位的降低，從而抑制細(xì)胞壞死。一方面，HBO提高梗死周?chē)M織氧供[16]，增加線(xiàn)粒體的ATP含量，從而減少細(xì)胞壞死，減輕組織損傷，另一方面又產(chǎn)生氧自由基，對(duì)膜電位到底有何影響，目前的研究尚未得出結(jié)論。

表2 各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（個(gè)）

表3 各組線(xiàn)粒體的羅丹明123熒光強(qiáng)度比較

本研究結(jié)果顯示大劑量HBO后，膜電位持續(xù)穩(wěn)定于較高水平，缺血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)在13 h降低，考慮HBO提供了充足的氧供，挽救了休眠細(xì)胞，所以凋亡細(xì)胞數(shù)減少。而72 h后，兩組凋亡細(xì)胞幾近相等，推測(cè)原因：一是MCAO后部分細(xì)胞壞死，故而凋亡數(shù)量減少，二是HBO持續(xù)作用時(shí)間有限，未能覆蓋缺血灶病理生理變化的全過(guò)程。本研究中HBO組大鼠72 h時(shí)腦梗死體積與13 h無(wú)顯著性差異，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡，所以梗死體積變化不大，而對(duì)照組72 h時(shí)梗死體積較13 h明顯擴(kuò)大，考慮此階段細(xì)胞壞死，故而梗死體積擴(kuò)大，這與本研究凋亡細(xì)胞數(shù)及線(xiàn)粒體膜電位的變化趨勢(shì)也是相符的，提示缺血超早期提供充足氧供，減少細(xì)胞凋亡，有助于縮小梗死容積，通過(guò)線(xiàn)粒體途徑影響細(xì)胞凋亡，可能是HBO的機(jī)制之一。本課題組以前的研究[17]發(fā)現(xiàn)，雖然9 h HBO可能增加了腦組織中某些自由基的含量，但不僅沒(méi)有加重過(guò)氧化損傷水平，反而顯著降低了實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織的過(guò)氧化損傷程度，可能是HBO產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用比自由基產(chǎn)生的損傷作用更強(qiáng)大。

此外，還有其他體內(nèi)體外的研究證實(shí)HBO可以通過(guò)線(xiàn)粒體途徑影響細(xì)胞凋亡。Weber等[18]將T細(xì)胞暴露于高壓氧氣中，發(fā)現(xiàn)1次30 min的HBO暴露即可通過(guò)線(xiàn)粒體機(jī)制引起淋巴細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)ai等[19]則認(rèn)為HBO治療早期急性胰腺炎大鼠，正是通過(guò)線(xiàn)粒體途徑引起外周血淋巴細(xì)胞凋亡，抑制了炎性反應(yīng)，從而降低了大鼠胰腺炎的程度。其機(jī)制包括凋亡誘導(dǎo)因子[13]轉(zhuǎn)位、神經(jīng)蛋白[20]等，有關(guān)機(jī)制本課題組亦將繼續(xù)研究。

本研究尚存以下局限：①觀(guān)察點(diǎn)較少，觀(guān)察時(shí)間短，可能不足以反映腦梗死過(guò)程中各指標(biāo)的演變過(guò)程；②樣本量小；③由于缺血半暗帶是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域，故取材定位的缺血半暗帶與實(shí)際的缺血半暗帶可能存在差距。

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