中國人群中動(dòng)脈硬化性腦小血管病易感基因及預(yù)測模型的研究

李偉，胡波，李桂林，張?jiān)趶?qiáng)，王擁軍

腦小血管病是最常見中老年、隱性、進(jìn)展性腦血管病，它是導(dǎo)致血管性癡呆最重要的一個(gè)原因。動(dòng)脈硬化是腦小血管病最常見病因。目前腦小血管病的研究，除了對(duì)環(huán)境因素和危險(xiǎn)因素（高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、老齡等）的研究外，遺傳背景因素是腦小血管病致病機(jī)制的重要內(nèi)容，它作為一種復(fù)雜性狀性疾病具備了多基因易感性的特點(diǎn)[1-3]。雖然現(xiàn)有的研究結(jié)果不盡人意，但根據(jù)全基因組卒中研究（genomewide association studies of stroke，GWAS）[4-6]，

結(jié)合腦小血管病的病理生理，病理學(xué)變化結(jié)果提示——腦小血管病的易感基因選擇可以涉及以下幾個(gè)方面：①脂代謝調(diào)節(jié)通路[7]；②炎性及Rho相關(guān)通路[8-9]；③血腦屏障細(xì)胞間連接調(diào)節(jié)通路[10-11]；④小血管病病理表現(xiàn)膠原纖維高表達(dá)的調(diào)節(jié)通路[12]。本研究旨在探討動(dòng)脈硬化性腦小血管病與候選易感基因相關(guān)性，構(gòu)建腦小血管病的預(yù)測模型，為腦小血管病致病機(jī)制和預(yù)防提供重要的基因背景證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院門診、住院部、腦血管病篩查門診及體檢門診，連續(xù)收集脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）樣本存入北京天壇醫(yī)院腦血管病基因庫。從2009年6月～2013年12月天壇醫(yī)院腦血管病基因庫樣本中隨機(jī)選出腦小血管病患者197例，大動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管?。ㄑ塥M窄率＞50%）患者198例，高血壓性腦出血患者200例，非卒中對(duì)照197例，共計(jì)792例。

腦小血管病入組標(biāo)準(zhǔn)[13]：符合腦小血管病磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRⅠ）或計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）影像學(xué)特點(diǎn)：①腦缺血性脫髓鞘改變；②腔隙性腦梗死；③血管周圍間隙擴(kuò)大；④腦內(nèi)微出血。并排除：①有穿支動(dòng)脈的父動(dòng)脈和供血?jiǎng)用}粥樣硬化性狹窄或閉塞（大、中動(dòng)脈＞50%的狹窄）證據(jù)的患者；②有心源性栓塞證據(jù)的患者；③有多發(fā)性硬化，血管炎，一氧化碳中毒及農(nóng)藥中毒性脫髓鞘，遺傳性白質(zhì)腦病，代謝性白質(zhì)腦病，化療，放療相關(guān)性腦白質(zhì)病證據(jù)的患者；④有動(dòng)脈夾層、肌纖維營養(yǎng)不良、煙霧病等大血管病變證據(jù)的患者；⑤拒絕參加本項(xiàng)研究患者。

大動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病入組標(biāo)準(zhǔn)[13]：①支持動(dòng)脈粥樣硬化性指標(biāo)［頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，ⅠMT）＞1.5 mm］；②頸動(dòng)脈血管超聲和經(jīng)顱多普勒檢查提示頸部動(dòng)脈或顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄率＞50%，或血管影像學(xué)檢查提示頸部動(dòng)脈或顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄率＞50%；③影像學(xué)提示相應(yīng)責(zé)任大動(dòng)脈供血區(qū)表現(xiàn)分水嶺梗死，或皮層、小腦、腦干及皮層下梗死病灶直徑＞1.5 cm腦梗死；④臨床表現(xiàn)為非腔隙綜合征表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心源性栓塞患者；②腦小血管病患者，或皮層下梗死及腦干梗死病灶直徑＜1.5 cm的患者；③有動(dòng)脈夾層、肌纖維營養(yǎng)不良、煙霧病證據(jù)的患者；④拒絕參加本項(xiàng)研究患者。

高血壓性腦出血入組標(biāo)準(zhǔn)：明確的高血壓病史，影像學(xué)提示基底節(jié)區(qū)出血性改變，并排除動(dòng)脈瘤，藥物相關(guān)性出血及血液系統(tǒng)疾病。

非卒中對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)RⅠ或CT等影像學(xué)檢查沒有任何類型腦血管病表現(xiàn)；②沒有卒中或短暫性腦缺血發(fā)作病史；③無腦血管病相應(yīng)癥狀和體征。

對(duì)腦小血管病、大動(dòng)脈粥樣硬化（血管狹窄率＞50%）及高血壓性腦出血病例，進(jìn)行病史采集，入院后測雙側(cè)肱動(dòng)脈血壓，血生化檢查（包括血常規(guī)，血脂，空腹血糖，血肌苷，血尿素氮，超敏C反應(yīng)蛋白，血漿同型半胱氨酸，紅細(xì)胞沉降率）；對(duì)腦小血管患者還進(jìn)行了抗中性粒細(xì)胞抗體，心磷脂抗體，抗核抗體/免疫全套，糖化血紅蛋白檢測。所有研究對(duì)象都進(jìn)行了頭影像學(xué)及相應(yīng)的血管影像學(xué)檢查，需要鑒別心源性卒中患者均進(jìn)行了超聲心動(dòng)圖檢查，24 h動(dòng)態(tài)心電監(jiān)測或多次心電圖檢查。

本項(xiàng)研究通過了倫理委員會(huì)醫(yī)學(xué)倫理批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 候選基因單核苷酸多態(tài)性的選擇 候選基因選擇經(jīng)過兩個(gè)步驟：第一，根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的熱門單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），以及美國國家生物技術(shù)信息中心（National in BiotechnologyⅠnformation，NCBⅠ）中頻率較高的錯(cuò)義SNP（插入與缺失＞15%）和影響基因表達(dá)的調(diào)控5’端tag SNP；第二，根據(jù)第一次的選擇位點(diǎn)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，在位點(diǎn)P值＜0.01所對(duì)應(yīng)的基因中，通過文獻(xiàn)及其基因功能的復(fù)習(xí)，重新遴選SNP位點(diǎn)。第一步驟共選擇19個(gè)基因55個(gè)SNP位點(diǎn)；第二步驟易感基因候選出4個(gè)基因，包括神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2（nerve injury induced protein 2，NⅠNJ2）、水通道蛋白4（Aquapofins 4，AQP4）、細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因2A（inhibitor of cdk 4/alternative reading frame，ⅠNK4/ARF）、肌球蛋白輕鏈激酶基因（myosin light chain kinase，MYLK），15個(gè)SNP位點(diǎn)（表1）。

1.3 單核苷酸多態(tài)性檢測 抽取患者的靜脈血5 ml（肝素抗凝），小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取全血DNA（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）。利用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型檢測。設(shè)計(jì)51對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物用于擴(kuò)增包含55個(gè)SNP位點(diǎn)的51個(gè)118～338 bp片段，也設(shè)計(jì)了55個(gè)緊鄰SNP位點(diǎn)的延伸引物用于單堿基延伸。引物設(shè)計(jì)用在線Primer 3軟件。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（Epicentre公司）純化后，SNaPshot多重試劑盒進(jìn)行延伸反應(yīng)（ABⅠ公司）。延伸產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶純化后，在基因測序儀（ABⅠ3130xl，ABⅠ公司）上樣。SNP分型用基因分型軟件GeneMapper 4.0（Applied biosystems）分析。以上試驗(yàn)由上海天昊生物有限公司協(xié)助完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 經(jīng)過年齡和性別校正后，SNP位點(diǎn)在5種遺傳模型下（共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型、疊加模型）用SAS分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用阿凱克信息準(zhǔn)則（The Akaike Ⅰnformation Criterion，AⅠC）計(jì)算各遺傳模型，選擇最小AⅠC值的遺傳模型。應(yīng)用permutation多重檢驗(yàn)進(jìn)行校正。數(shù)量變量應(yīng)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)變量使用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析。本試驗(yàn)采用SAS統(tǒng)計(jì)件軟Logistic模塊進(jìn)行預(yù)測模型的分析，應(yīng)用基尼指數(shù)（GⅠNⅠ）表現(xiàn)其效果。

表1 腦小血管病候選4個(gè)基因及15個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)

2 結(jié)果

研究對(duì)象平均年齡為（58.05±11.5）歲。危險(xiǎn)因素分析經(jīng)過年齡、性別校正后，可見糖尿病比例分別是動(dòng)脈粥樣硬化性腦大血管病40.26%，腦小血管病29.53%，高血壓性腦出血19.29%，各組之間存在顯著性差異（P＜0.001）；高血壓腦出血組與腦小血管病組比較（P=0.02），大動(dòng)脈粥樣硬化組與腦小血管病組比較（P=0.02）。高脂血癥和吸煙發(fā)生率在各組間也有顯著差異（P＜0.001和P=0.002），在大動(dòng)脈粥樣硬化組發(fā)生率最高，兩兩比較顯示，大動(dòng)脈粥樣硬化組高脂血癥發(fā)生率顯著高于高血壓腦出血組（P=0.001）和腦小血管病組（P=0.001）；大動(dòng)脈粥樣硬化組吸煙率顯著高于高血壓腦出血組（P=0.003）和腦小血管病組（P=0.001）（表2）。

AⅠC值最小的SNP位點(diǎn)的遺傳模式是超顯性模型（overdominant model）（圖1）。腦小血管病與非卒中對(duì)照組個(gè)體差異性檢驗(yàn)，MYLK基因rs2222823雜合子（A/T）的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）為0.52，95%可信區(qū)間（conf i dence interval，CⅠ）為（0.35～0.79），P=0.002，校正P=0.031）；ⅠNK4/ARF基因rs2811712雜合子（C/T）的OR值為1.75［95%CⅠ（1.13～2.71），P=0.004，校正P=0.050］（表3，圖2）。腦小血管病與高血壓性腦出血患者差異性檢驗(yàn)，rs2222823位點(diǎn)的P值為0.035。在腦小血管病與動(dòng)脈硬化性腦大血管病患者差異性檢驗(yàn)中，非糖尿病患者及飲酒患者在rs2222823位點(diǎn)P值分別為0.012和0.018；高脂血癥及飲酒患者在rs2811712位點(diǎn)P值分別為0.029和0.04。依據(jù)易感基因構(gòu)建腦小血管的預(yù)測模型的GⅠNⅠ值為0.442。

3 討論

本研究表明MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)，rs2222823和rs2811712，與腦小血管疾病顯著相關(guān)。SNP位點(diǎn)rs2222823位于MYLK基因啟動(dòng)子的tagSNPs的區(qū)域，rs2811712位與ⅠNK4/ARF基因的5’端區(qū)域，均位于這兩個(gè)基因的重要功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有決定基因功能的重要意義，因此提示腦小血管病與MYLK基因和ⅠNK4/ARF基因密切相關(guān)。在SNP位點(diǎn)rs2222823（MYLK基因）雜合基因型（T/A）對(duì)腦小血管疾病有保護(hù)作用，而在位點(diǎn)SNP rs2811712雜合基因型（C/T）對(duì)腦小血管病有促進(jìn)作用。

圖1 不同遺傳模型下AIC值的比較注：*：rs2811712；**：rs2222823；AIC：阿凱克信息準(zhǔn)則

表2 研究對(duì)象的基本信息情況

表3 性別和年齡校正后腦小血管病與非卒中對(duì)照在超顯性遺傳模式下相關(guān)性分析

圖2 rs2222823與rs2811712不同基因型的OR值情況注：OR：優(yōu)勢比

2007年Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)MYLK基因與動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)。2009年Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活的肌球蛋白輕鏈激酶具有增強(qiáng)血管內(nèi)皮通透性的作用[16]。最近多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)ⅠNK4/ARF基因與衰老[17-18]和老年疾病如心肌梗死、卒中、2型糖尿病密切關(guān)聯(lián)[19-20]。動(dòng)脈硬化性腦小血管病為一種動(dòng)脈硬化微血管病變，其中血-腦屏障通透性增加是其重要的病理生理變化。因此，這些研究均提示MYLK和ⅠNK4/ARF基因與血腦屏障功能障礙和動(dòng)脈硬化有關(guān)。Burton等研究者多項(xiàng)研究表明ⅠNK4/ARF基因SNP位點(diǎn)rs1333049區(qū)域與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和卒中密切相關(guān)[21-23]。而本研究結(jié)果顯示NK4/ARF基因rs2811712位點(diǎn)與腦小血管病的卒中亞型有關(guān)，這可能是由于種族差異導(dǎo)致的不同的SNP位點(diǎn)結(jié)果。但同樣說明在染色體9p21.3區(qū)域的ⅠNK4/ARF基因與卒中相關(guān)，很可能與腦小血管病有關(guān)。在5種遺傳模型基因型分析中AⅠC值最低的是超顯性模型。雖然在卒中很少觀察由于超顯性模型易致病性的報(bào)道，但許多研究中發(fā)現(xiàn)了超顯性遺傳模式與疾病相關(guān)[24]，如癌癥的一些研究中表明，在超顯性模型下某些基因的多態(tài)性與癌癥密切相關(guān)[25-26]。因此，將來需要深入研究在超顯性遺傳模型下腦小血管病易感基因的作用。

在理論上可能導(dǎo)致這種雜合子偏倚的原因有以下幾種情況：從技術(shù)上講，可以是由使用不準(zhǔn)確的限制性內(nèi)切酶造成的，而本試驗(yàn)應(yīng)用的基因分型技術(shù)不會(huì)造成這種情況。從分子學(xué)角度，它可能是具有非常強(qiáng)大的主導(dǎo)性的變異等位基因，使雜合子具有等同于純合子效果。在統(tǒng)計(jì)學(xué)角度，由于變異純合子在病例和對(duì)照組相對(duì)樣本較少，變異純合子比較雜合子的效果可能會(huì)存在選擇性偏倚，簡單的說，就是統(tǒng)計(jì)力度不夠，不能反映變異純合子的真實(shí)效果，只能通過更大的研究樣本予以糾正。在預(yù)測模型評(píng)估方面，模型預(yù)測效果可以用GⅠNⅠ值來衡量，GⅠNⅠ越接近1，說明模型的表現(xiàn)越好，而本研究GⅠNⅠ值偏低，并且由于沒有大樣本來驗(yàn)證這些結(jié)果，模型的表現(xiàn)可能非常不穩(wěn)定。所以單純應(yīng)用基因型預(yù)測復(fù)雜性狀性疾病的預(yù)測模型具有很大局限性，也就是說，復(fù)雜性狀性疾病預(yù)測模型構(gòu)建除涵蓋易感基因外，還需要增加危險(xiǎn)因素等因子才能增強(qiáng)預(yù)測模型的力度。另外，本研究樣本例數(shù)相對(duì)較小，下一步仍需要更大樣本量驗(yàn)證這兩個(gè)SNP位點(diǎn)與腦小血管病的關(guān)系。

總之，MYLK和ⅠNK4/ARF基因與中國人群中動(dòng)脈硬化性腦小血管病有顯著相關(guān)性，MYLK基因rs2222823雜合子（A/T）有減緩腦小血管病患病率作用，而ⅠNK4/ARF基因rs2811712雜合子（C/T）對(duì)腦小血管病的患病率具有促進(jìn)作用。預(yù)測模型需要增加更多的變量來加大模型的效度。

1 張?jiān)趶?qiáng), 王擁軍. 腦小血管病基礎(chǔ)研究的爭議與啟示[J].中國卒中雜志, 2013, 8:423-425.

2 徐琴, 張微微, 魏微. 腦小血管病的研究進(jìn)展[J]. 中國腦血管病雜志, 2013, 10:549-553.

3 梁永平, 李寶民, 潘卿. 腦小血管病發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)影像學(xué)特征[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 35:773-775.

4 Ikram MA, Seshadri S, Bis JC, et al. Genomewide association studies of stroke[J]. N Engl J Med, 2009,360:1718-1728.

5 Liu Y, Sanoff HK, Cho H, et al. INK4/ARF transcript expression is associated with chromosome 9p21 variants linked to atherosclerosis[J]. PLoS One, 2009,4:e5027.

6 Burd CE, Jeck WR, Liu Y, et al. Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk[J].PLoS Genet, 2010, 6:e1001233.

7 Yamada Y1, Fuku N, Tanaka M. Identification of CELSR1 as a susceptibility gene for ischemic stroke in Japanese individuals by a genome-wide association study[J]. Atherosclerosis, 2009, 207:144-149.

8 Fornage M, Chiang YA, O'Meara ES, et al. Biomarkers of inf l ammation and MRI-def i ned small vessel disease of the brain:The Cardiovascular Health Study[J].Stroke, 2008, 39:1952-1959.

9 Matsushita T, Ashikawa K, Yonemoto K, et al.Functional SNP of ARHGEF10 confers risk of atherothrombotic stroke[J]. Hum Mol Genet, 2010,19:1137-1146.

10 Verin AD, Gilbert-McClain LI, Patterson CE, et al.Biochemical regulation of the nonmuscle myosin light chain kinase isoform in bovine endothelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998, 19:767-776.

11 Shen L, Black ED, Witkowski ED, et al. Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure[J]. J Cell Sci, 2006,119:2095-2106.

12 Lindahl K, Rubin CJ, Br?ndstr?m H, et al.Heterozygosity for a coding SNP in COL1A2 confers a lower BMD and an increased stroke risk[J]. Biochem Biophy Res Commun, 2009, 384:501-505.

13 Amarenco P, Bogousslavsky J, Caplan LR, et al.New approach to stroke subtyping:The A-S-C-O(Phenotypic) classification of stroke[J]. Cerebrovasc Dis, 2009, 27:502-508.

14 Wang L, Hauser ER, Shah SH, et al. Peakwide mapping on chromosome 3q13 identifies the kalirin gene as a novel candidate gene for coronary artery disease[J]. Am J Hum Genet, 2007, 80:650-663.

15 Su L, Shen L, Clayburgh DR, et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis[J]. Gastroenterology, 2009, 136:551-563.

16 Beard RS Jr, Haines RJ, Wu KY, et al. Non-muscle Mlck is required for β-catenin- and FoxO1-dependent downregulation of Cldn5 in IL-1β-mediated barrier dysfunction in brain endothelial cells[J]. J Cell Sci,2014, 127:1840-1853.

17 Melzer D. Genetic polymorphisms and human aging:Association studies deliver[J]. Rejuvenation Res,2008, 11:523-526.

18 González-Navarro H, Vinué á, Sanz MJ, et al.Increased dosage of Ink4/Arf protects against glucose intolerance and insulin resistance associated with aging[J]. Aging Cell, 2013, 12:102-111.

19 Matarin M, Brown WM, Singleton A, et al. Whole genome analyses suggest ischemic stroke and heart disease share an association with polymorphisms on chromosome 9p21[J]. Stroke, 2008, 39:1586-1589.

20 Sharpless NE, DePinho RA. How stem cells age and why this makes us grow old[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2007, 18:703-713.

21 Burton PR, Clayton DG, Cardon LR, et al. Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14 000 cases of seven common diseases and 3000 shared controls[J]. Nature, 2007,447:661-678.

22 Samani NJ, Erdmann J, Hall AS, et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease[J]. N Engl J Med, 2007, 357:443-453.

23 Karvanen J, Silander K, Kee F, et al. The impact of newly identif i ed loci on coronary heart disease, stroke,and total mortality in the MORGAM prospective cohorts[J]. Genet Epidemiol, 2009, 33:237-246.

24 Comings DE, MacMurray JP. Molecular heterosis:A review[J]. Mol Genet Metab, 2000, 71:19-31.

25 Jazdzewski K, Liyanarachchi S, Swierniak M, et al.Polymorphic mature microRNAs from passenger strand of pre-miR146a contribute to thyroid cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:1502-1505.

26 Cui R, Kamatani Y, Takahashi A, et al. Functional variants in ADH1B and ALDH2 coupled with alcohol and smoking synergistically enhance esophageal cancer risk[J]. Gastroenterology, 2009, 137:1768-1775.